背景[1-3]
NCI-H82人小细胞肺癌贴壁细胞系是一种来源于人类小细胞肺癌的贴壁细胞系。这些细胞系是通过将小细胞肺癌组织样本移植到实验室培养皿中，并使用特定的生长条件和培养基来分离和培养的。
NCI-H82人小细胞肺癌贴壁细胞系通常用于研究小细胞肺癌的发生、发展和治疗。这些细胞系可以提供一个体外模型，用于评估新的抗癌药物的疗效，以及研究肿瘤细胞的生物学特性和分子机制
NCI-H82人小细胞肺癌贴壁细胞系
NCI-H82人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞培养方法：
1、NCI-H82人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、NCI-H82人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、NCI-H82人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。
应用[4-5]
NCI-H82人小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于养阴解毒方激活转录因子EGR1诱导肺癌细胞凋亡的分子机制研究
通过应用高通量组学技术从诱导细胞凋亡方面探讨养阴解毒方抑制肿瘤生长的作用机制,丰富“益气养阴法”抗肺癌理论内涵。
方法1.体外研究养阴解毒方对肺癌细胞生长的影响。采用CCK-8(Cell Counting Kit8)法,检测不同浓度,不同时间点养阴解毒方对非小细胞肺癌细胞系(A549、NCI-H2228、NCI-H1299、NCI-H1975、NCI-HCC827、Lewis)细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC50,Half maximal inhibitory concentration)明确养阴解毒方的敏感细胞株;采用PI(Propidium Iodide)染色、流式细胞术检测不同浓度养阴解毒方对A549、NCI-H2228、NCI-H1299细胞周期的影响;分别采用Hochest 33342染色法及Annexin V-FITC/PI双染检测不同浓度养阴解毒方对A549、NCI-H2228、NCI-H1299细胞凋亡的影响;
2. 体外研究养阴解毒方干扰A549细胞后基因表达变化。采用转录组测序技术(RNA-seq,RNA Sequencing)检测加入和不加入养阴解毒方对A549细胞基因表达变化的影响;通过DAVID(Database for Annotation,Visualization,and Integrated Discovery)数据库分析差异基因生物学功能;
3. 研究EGR1(Early growth response protein 1)对养阴解毒方诱导细胞凋亡的影响。应用RNA干扰技术敲减EGR1在A549细胞中的表达,在体外通过CCK-8法,Annexin V-FITC/PI双染法检测沉默EGR1后养阴解毒方的抑制肺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡作用;
4. 体外研究养阴解毒方干扰下全基因组范围内EGR1结合位点。采用免疫共沉淀测序技术(ChIP-seq,Chromatin Immunoprecipitation Followed by High-throughput Sequencing)检测养阴解毒方干预A549细胞后EGR1全基因组结合位点,并与RNA-seq数据共同分析,构建养阴解毒方通过激活EGR1诱导肺癌细胞凋亡的调控网络;
5. 体内实验通过构建Lewis肺癌皮下移植瘤模型,将C57 BL/6小鼠随机分为生理盐水组、养阴解毒方组、顺铂组、养阴解毒方联合顺铂组,干预14天,测量瘤体生长,干预结束后评价养阴解毒方对肿瘤的生长抑制作用,剥离瘤体进行免疫组化检测养阴解毒方对EGR1及下游KLF11、BCL2L11蛋白表达的影响。
6. 养阴解毒方药物安全性研究。通过应用养阴解毒方对两种不同品系小鼠进行灌胃,干预30天后取血检测肝肾,取重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)称重计算脏器指数,HE染色观察脏器病理形态;
结果1.体外研究结果显示,养阴解毒方对多种肺癌细胞(A549、NCI-H2228、NCI-H1299、NCI-H1975、NCI-HCC827、Lewis)有生长抑制作用,且具有时间和浓度依赖性,48h IC50分别为:62.77,55.94,105.40,118.90,116.60,127.70μg/ml;高剂量养阴解毒方能阻滞A549、NCI-H2228、NCI-H1299细胞停滞在G2/M期(*P<0.05),高剂量养阴解毒方组三种细胞的G2/M期的比例分别为:(82.13±1.39)%(81.34±1.58)%(55.28±5.37)%;通过Hochest 33342染色后的发现加入养阴解毒方后肺癌细胞(A549、NCI-H2228、NCI-H1299)细胞核出现凋亡形态;并通过Annexin V-FITC/PI双染进一步证实养阴解毒方可以引起肺癌细胞凋亡,其中A549、NCI-H2228,NCI-H1299细胞总凋亡率分别为:(20.78±0.39)%(15.71±0.38)%,(11.44±0.84)%;
2.RNA-seq分析表明,加入养阴解毒方48h前后共有2,178个差异基因(P<0.05),其中上调的基因有1,464个(67.2%),下调的基因有714个(32.8%);GO分析差异基因结果显示多个生物学过程涉及凋亡进程;进一步分析差异基因表明EGR1为变化最明显的基因;Western blot结果表明养阴解毒方可以明显上调A549、NCI-H2228,NCI-H1299细胞中EGR1蛋白的表达;3.敲减EGR1后,养阴解毒方抑制A549细胞增殖作用及诱导A549细胞凋亡的能力明显下降;
参考文献
[1]Cancer statistics,2019.Rebecca L.Siegel MPH;;Kimberly D.Miller MPH;;Ahmedin Jemal DVM,PhD.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2019
[2]Polyphyllin I Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis by Downregulating AML1‐ETO and Suppressing C‐KIT/Akt Signaling in t(8;21)Acute Myeloid Leukemia.Yanting Chai;;Ying Si;;Jiaxin Xu;;Yuchen Xiang;;Hongyan Zhao;;Yuan Si;;Te Zhang;;Ying Liu.Chemistry&Biodiversity,2018
[3]Neferine suppresses diethylnitrosamine-induced lung carcinogenesis in Wistar rats.Kalaiselvi Sivalingam;;Vinoth Amirthalingam;;Karunagaran Ganasan;;Chih-Yang Huang;;Vijaya Padma Viswanadha.Food and Chemical Toxicology,2018
[4]In Vitro and In Vivo Inhibitory Effect of Gujin Xiaoliu Tang in Non-Small Cell Lung Cancer.Chao Hou;;Dai-Han Zhou;;Yong-Jian Wu;;Xiao-Jun Dai;;Qing-Ying Wang;;Yin-Qiu Wu;;En-Xin Zhang;;Shuang-En Chuang.Evidence-Based Complementary and Alternative Medi,2018
[5]杨文笑.养阴解毒方激活转录因子EGR1诱导肺癌细胞凋亡的分子机制研究[D].上海中医药大学,2021.