背景[1-3]
LK-2人肺癌贴壁细胞系是一种来源于人肺癌的贴壁细胞系。它是一种体外培养的肿瘤细胞系，可用于研究肺癌的发生、发展和治疗。
LK-2人肺癌贴壁细胞系的特点是具有高度的贴壁生长能力，能够在培养皿中形成紧密的单层细胞。此外，它还具有多药耐药性，即对多种化疗药物具有抵抗力。因此，LK-2人肺癌贴壁细胞系在肺癌研究中具有重要的应用价值。
LK-2人肺癌贴壁细胞系可以通过多种方法进行分离和培养，包括组织块法、悬浮培养法和单细胞克隆法等。在实验室中，可以通过对其进行基因编辑、蛋白质表达分析等研究手段，深入了解肺癌的发生机制和治疗方法。
LK-2人肺癌贴壁细胞系
LK-2人肺癌贴壁细胞系细胞培养操作
1)复苏LK-2人肺癌贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)LK-2人肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)LK-2人肺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
LK-2人肺癌贴壁细胞系可以用于CYP24A1基因单核苷酸多态性对女性肺癌发生及预后的作用及相关机制研究
使用用TCGA数据库测序数据和GEO数据库的组织芯片数据,应用GEPIA在线分析平台探究CYP24A1 mRNA在肺腺癌组织、肺鳞癌以及正常肺组织中的表达情况。接着,对不同类型肺癌细胞系中CYP24A1 mRNA表达量的影响进行了探究。分别配置含有高、中、低浓度1,25(OH)2D3的细胞培养液。将培养液分别加入A549肺腺癌细胞系,LK-2人肺癌贴壁细胞系进行细胞培养。于培养24h、48h观察细胞形态,酶标仪检测量吸光度,并收集细胞,进行CYP24A1mRNA含量的测定。
观察1,25(OH)2D3对不同种类肺癌细胞系的抗增殖作用以及对CYP24A1 mRNA表达量的影响。接着向A549肺腺癌细胞系中瞬时转入野生型(C等位基因)和突变型(T等位基因)质粒。在1,25(OH)2D3条件下培养,并利用CCK-8实验检测细胞增殖的改变情况。利用7-AAD和Annexin V-APC染料将LK-2人肺癌贴壁细胞系细胞染上荧光染料,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。将细胞固定后,利用PI染料将细胞中的DNA染上荧光染料,应用流式细胞仪检测细胞周期情况,从而判断不同基因型rs6068816位点对肺癌生物学行为的影响。
结果:1.由生物信息学分析得到的结果发现,位于CYP24A1编码区的rs6068816位点可能影响基因的功能,且功能评分最高,故选取rs6068816位点作为研究的靶点。通过Taqman基因分型得到的结果发现,rs6068816位点上的T等位基因与降低非吸烟女性肺癌的发病风险相关,在肺腺癌和中晚期肺癌中,该位点的T等位基因也与降低非吸烟女性肺癌的发病风险相关,差异具有统计学意义。另外还发现在有油烟暴露的情况下,rs6068816位点上的T等位基因同样是一个保护因素。病理类型、临床分期和是否化疗对非吸烟女性肺癌患者的生存期存在影响。但rs6068816位点与非吸烟女性肺癌患者的生存时间无相关性。
2.GEPIA平台的分析结果显示,在人体组织中,肺腺癌和肺鳞癌的CYP24A1mRNA表达量均高于正常肺组织,且肺腺癌组织中的CYP24A1 mRNA表达量要高于肺鳞癌组织。分别将A549肺腺癌细胞系和LK-2人肺癌贴壁细胞系在含有高、中、低浓度的1,25(OH)2D3培养液中培养24h、48h后,A549细胞系和LK-2人肺癌贴壁细胞系中的CYP24A1 mRNA的表达量随着1,25(OH)2D3浓度的增加而增加。与阴性对照组相比,中、高浓度组中A549和LK-2人肺癌贴壁细胞系中CYP24A1 mRNA表达量都显著增高。随着1,25(OH)2D3浓度的增加,A549和LK-2人肺癌贴壁细胞系的增殖受到抑制。与阴性对照组相比,中、高浓度组中LK-2人肺癌贴壁细胞系的吸光度降低明显,而A549细胞系的吸光度下降并不明显。与野生型相比,rs6068816突变型更能够抑制A549细胞增殖能力,细胞凋亡受到促进,凋亡细胞所占比例增加。经过1,25(OH)2D3处理的野生型组和突变型组,与未经1,25(OH)2D3处理的对照组相比,也都出现了抑制A549肺腺癌细胞系的增殖,促进A549肺腺癌细胞系凋亡的结果。
参考文献
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[3]Lung cancer:current therapies and new targeted treatments.Fred R Hirsch;;Giorgio V Scagliotti;;James L Mulshine;;Regina Kwon;;Walter J Curran;;Yi-Long Wu;;Luis Paz-Ares.The Lancet,2017
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[5]屈若祎.CYP24A1基因单核苷酸多态性对女性肺癌发生及预后的作用及相关机制研究[D].中国医科大学,2020.