背景技术
随着生活水平的提高,糖尿病也越来越普遍化和年轻化,给无数家庭带来灾难性的打击。然而相较于糖尿病本身,它的一些并发症比如糖尿病酮症酸中毒(DKA),更容易威胁到人类的生命。引起DKA的酮体包括78%的(R)-3-羟基丁酸、20%的乙酰乙酸(AcAc)丙酮、2%三种,主要成分是(R)-3-羟基丁酸。当乙酰乙酸和(R)-3-羟基丁酸的含量超过血液中碳酸盐的缓冲能力时,就会导致酮中毒。由于糖尿病患者的糖利用率大大降低,而且,往往酮体含量的变化出现在作为糖尿病重要体征的血糖或者尿糖含量增高之前。同时,(R)-3-羟基丁酸的含量高且相对稳定,不受溶血、黄疸等的干扰,能够准确反映体内酮体水平。因此,美国糖尿病协会(ADA)早在1995年就建议将(R)-3-羟基丁酸的检测作为DKA的可靠的指标,并且正常人体内(R)-3-羟基丁酸浓度小于1mmo1/L,高于3mmol/L 就可以确定为酮症酸中毒。因此,酮体中(R)-3-羟基丁酸含量的测定对于预防糖尿病以及其并发症等有很重要的意义[1]。
生产(R)-3-羟基丁酸的传统方法包括化学合成法,以及先采用微生物合成聚(R)-3-羟基丁酸(PHB),然后降解该聚合物而得到产品的方法。由于上述两种方法的工艺均较复杂,生产投入大,使(R)-3-羟基丁酸的成本较高。基因phaA或phbA编码催化合成乙酰乙酰辅酶A的β-酮硫解酶;基因phaB或phbB编码催化合成D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A的乙酰乙酰辅酶A还原酶,基因phaA或 phbA 与phaB 或phbB联合运用催化生成羟基丁酰辅酶A;基因ptb编码磷酸转丁酰基酶;基因buk编码丁酸激酶,基因ptb,buk联合运用能够催化羟基丁酰辅酶A生成(R)-3-羟基丁酸[2]。
生产工艺
1、高温低pH以葡萄糖为碳源分批培养重组大肠杆菌合成(R)-3-羟基丁酸
菌种:含单质粒的重组大肠杆菌,质粒中基因phbA为(J04987)、phbB为(J04987),基因ptb为(L04468),buk为(L04468)。
质粒转化方式:化学转化法;培养温度:42℃;培养基:培养基1;pH:5.5;通气量:3L/min;发酵时间:36小时;搅拌转速:150~900rpm
工艺流程如下:将种子液接入加有灭菌发酵液的发酵罐中,接种量为每升发酵液接入100毫升种子液。葡萄糖浓度40g/L。起始搅拌150rpm,溶氧设置为10%,随着细胞的生长,搅拌不断增加,最后至900rpm,但溶氧始终维持高于10%。发酵结束后,对样品离心、洗涤、分析得到细胞干重和(R)-3-羟基丁酸含量等有关数据。36小时后得到(R)-3-羟基丁酸含量为12g/L。
2、低温高pH以蔗糖为碳源,蛋白胨为有机氮源恒定浓度流加培养重组大肠杆菌合成(R)-3-羟基丁酸
菌种:含双质粒的重组大肠杆菌,质粒中的基因phaA为(AF029714)、phaB为(AF029714),基因ptb为(AB035092),buk为(AB035092)。
质粒转化方法:电击转化法;培养温度:28℃;培养基:培养基2;pH:8.5;通气量:2L/min;发酵时间:48小时;搅拌转速:150~900rpm
工艺流程如下:将种子液接入加有灭菌发酵液的发酵罐中,接种量为每升发酵液接入100毫升种子液。牛肉浸出物10g/L,初始蔗糖浓度30g/L,起始搅拌150r/m,通过控制搅拌速度控制溶氧浓度高于10%。发酵过程中监测蔗糖浓度变化,当浓度达到10g/L时开始用可控流速泵流加基质,并控制蔗糖浓度10g/L。流加结束后,继续培养,直至碳源消耗完全。发酵结束后,对样品离心、洗涤、分析得到细胞干重和(R)-3-羟基丁酸含量等有关数据。48小时得到(R)-3-羟基丁酸25g/L。
参考文献
[1] 盐城师范学院. 一种用于测定D-3-羟基丁酸的试剂盒:CN201810438364.6[P]. 2018-10-19.
[2] 清华大学. 一种生产D-(-)-3-羟基丁酸的方法:CN02100014.X[P]. 2003-07-16.