背景[1-3]
C-28/I2人正常软骨细胞系是一种来源于人类正常软骨组织的细胞系。这些细胞在实验室条件下可以进行培养和研究，以深入了解人正常软骨细胞的生物学特性、分化机制以及与软骨相关疾病的关系。
C-28/I2人正常软骨细胞系的研究对于理解软骨细胞的生长、分化、代谢以及与软骨相关疾病的发病机制具有重要意义。通过对这些细胞的研究，科学家们可以探索软骨细胞的分化调控机制、骨关节炎等软骨相关疾病的发病机制，以及寻找新的治疗靶点和药物。
在实验室中，C-28/I2人正常软骨细胞系通常通过细胞培养技术进行培养和繁殖。科学家们使用特定的培养基和条件，模拟体内的环境，以促进细胞的生长和分化。通过这些细胞培养实验，可以观察细胞的形态、生长速度、分化状态等指标，以评估软骨细胞的生物学特性和治疗效果。
C-28/I2人正常软骨细胞系
C-28/I2人正常软骨细胞系细胞培养操作
1)复苏C-28/I2人正常软骨细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)C-28/I2人正常软骨细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)C-28/I2人正常软骨细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
C-28/I2人正常软骨细胞系可以用于氟通过促进Ihh/PTHrP信号通路下游HDAC4核表达抑制C-28/I2人正常软骨细胞系增殖分化
通过对C-28/I2人正常软骨细胞系进行染氟处理,检测软骨细胞增殖、分化标志因子(Col2a1、Sox9和Col10a1)以及Ihh/PTHrP信号通路相关因子(PTHrP、Ihh、Mef2C、Runx2和p38)的表达,并且检测HDAC4在软骨细胞中的表达及磷酸化水平,探讨氟对C-28/I2人正常软骨细胞系增殖、分化的影响和Ihh/PTHrP信号通路及下游HDAC4等相关因子在其中的调控作用,进一步阐明氟损伤软骨发育的机制。
实验方法:本研究选取C-28/I2人正常软骨细胞系,用不同浓度NaF处理不同时间,通过CCK-8法选取最佳染氟剂量和时间。采用阿利新蓝染色检测软骨细胞蛋白多糖的表达,并采用实时荧光定量PCR检测软骨细胞中ACAN mRNA的表达;采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测软骨细胞增殖标志因子Col2a1和Sox9以及分化标志因子Coll0a1的mRNA和蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测Ihh/PTHrP信号通路相关因子PTHrP、Ihh、Mef2C和Runx2的mRNA和蛋白表达水平;采用免疫荧光法检测软骨细胞中HDAC4的表达,并用免疫印迹法检测HDAC4的磷酸化水平;采用免疫印迹法检测p38的磷酸化水平。
结果:1、氟对C-28/I2人正常软骨细胞系活力的影响:经过10-6 mol/L、10-5mol/L和10-4 mol/LNaF处理C-28/I2人正常软骨细胞系72h后,细胞活力与对照组相比无明显改变,而10-3 mol/L NaF处理72h后细胞活力与对照组相比明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。与对照组相比,用10-3 mol/L NaF处理C-28/I2人正常软骨细胞系24h,细胞活力无明显改变,但处理48h和72h后C28/I2细胞活力均明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。因此,后续实验采用10-3 mol/LNaF处理C-28/I2人正常软骨细胞系48h和72h。
2、氟对C-28/I2人正常软骨细胞系蛋白多糖表达的影响:NaF组阿利新蓝染色较对照组浅,定量结果显示C-28/I2人正常软骨细胞系中蛋白多糖表达减少,差异具有显著性(P<0.05);NaF组软骨细胞中ACAN mRNA表达较对照组明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。
3、氟对C-28/I2人正常软骨细胞系增殖和分化标志因子表达的影响:NaF组C-28/I2人正常软骨细胞系增殖标志因子Col2a1 mRNA和蛋白表达均较对照组降低,差异具有显著性(P<0.05);NaF组Sox9mRNA表达较对照组有下降趋势,但无显著性(P>0.05),Sox9蛋白表达明显下降,差异具有显著性(P<0.05);与对照组相比,NaF组软骨细胞分化标志因子Coll0a1 mRNA无明显改变,但蛋白表达水平降低,差异具有显著性(P<0.05)。
4、氟对C-28/I2人正常软骨细胞系Ihh/PTHrP负反馈环及下游信号分子的影响:与对照组相比,NaF组PTHrP mRNA和蛋白表达水平均明显升高,差异具有显著性(P<0.05),NaF组Ihh、Mef2C和Runx2的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比均明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。
5、氟对C-28/I2人正常软骨细胞系HDAC4蛋白表达的影响:免疫荧光结果表明,HDAC4主要表达在C-28/I2人正常软骨细胞系细胞核中,细胞质中有少量表达。NaF组软骨细胞细胞核中HDAC4荧光强度相较于对照组明显增加;NaF组C-28/I2人正常软骨细胞系HDAC4磷酸化水平下降,p-HDAC4/HDAC4较对照组明显降低,差异有显著性(P<0.05)。
6、氟对C-28/I2人正常软骨细胞系p38蛋白表达的影响:与对照组相比,NaF组p38蛋白磷酸化水平下降,p-p38/p38明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。
参考文献
[1]PTHrP targets salt-inducible kinases,HDAC4 and HDAC5,to repress chondrocyte hypertrophy in the growth plate[J].Nishimori Shigeki;Wein Marc N.;Kronenberg Henry M..Bone,2021
[2]Inhibition against p38/MEF2C pathway by Pamapimod protects osteoarthritis chondrocytes hypertrophy.[J].Zhang Jian;Yan Chen;He Weidong;Wang Min;Liu Jian.Panminerva medica,2020
[3]Histone deacetylase 4 deletion results in abnormal chondrocyte hypertrophy and premature ossification from collagen type 2α1‑expressing cells.[J].Guoqing Du;;Chuan Xiang;;Xiaowen Sang;;Xiang Wang;;Ying Shi;;Nan Wang;;Shaowei Wang;;Pengcui Li;;Xiaochun Wei;;Min Zhang;;Lilan Gao;;Hongsheng Zhan;;Lei Wei.Molecular medicine reports,2020
[4]Molecular Mechanism of Runx2-Dependent Bone Development.[J].Komori Toshihisa.Molecules and cells,2020
[5]高瑛.氟通过促进Ihh/PTHrP信号通路下游HDAC4核表达抑制C28/I2软骨细胞增殖分化[D].中国医科大学,2022.