背景[1-3]
MDA-MB-468人乳腺癌细胞是一种来源于人类乳腺癌的细胞系，具有高度的增殖能力和侵袭性。这种细胞系通常用于研究乳腺癌的生物学特性、药物筛选和治疗策略等方面。
MDA-MB-468人乳腺癌细胞系的建立始于1970年代，当时美国科学家从一名患有乳腺癌的女性患者身上获取了肿瘤组织样本，并成功地将其培养成了一种稳定的细胞系。该细胞系具有以下特点：
高度增殖：MDA-MB-468人乳腺癌细胞系在体外培养条件下生长迅速，能够快速扩增。
高侵袭性：MDA-MB-468人乳腺癌细胞系具有较强的侵袭性，能够在体外穿过人工基质并进入周围组织。
多药耐药性：MDA-MB-468人乳腺癌细胞系对多种化疗药物表现出耐药性，这使得该细胞系成为研究多药耐药机制的重要模型。
MDA-MB-468人乳腺癌细胞
MDA-MB-468人乳腺癌细胞培养操作
1)复苏MDA-MB-468人乳腺癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)MDA-MB-468人乳腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)MDA-MB-468人乳腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
MDA-MB-468人乳腺癌细胞可以用于石斛酚对顺铂诱导乳腺癌细胞凋亡的作用及其机制研究
通过网络药理学与分子对接手段,预测石斛酚对乳腺癌的潜在作用靶点通路,并通过实验研究石斛酚对顺铂诱导的乳腺癌细胞凋亡的作用,以及通过分子生物学的方法初步探讨并验证石斛酚对顺铂诱导的乳腺癌细胞凋亡的可能作用机制。
方法:(1)基于石斛酚的2D分子结构,利用网络药理学研究方法,集合石斛酚对乳腺癌的潜在作用靶点,建立作用靶点交互图,并对靶点基因进行富集分析,筛选潜在作用信号通路,利用分子对接,将石斛酚3D结构与信号通路相关蛋白进行对接。
(2) 采用MTT法检测石斛酚(2.5、5、10、20、40、80、160、320μM)对MDA-MB-468人乳腺癌细胞、MCF-7作用24、48、72 h的增殖活力的影响,并筛选一定的浓度进行后续的联用效果考察。
(3) 利用MTT法检测顺铂对MDA-MB-468人乳腺癌细胞、MCF-7作用48h的IC50,并检测不同浓度石斛酚(20、40、60μM)联合顺铂作用于乳腺癌细胞48 h时的增殖活力,计算联用情况下的顺铂作用48h的IC50,并与单用顺铂48 h的IC50比较。
(4) 采用克隆形成实验检测不同浓度石斛酚(40、60μM)对顺铂作用于MDA-MB-468人乳腺癌细胞的克隆形成能力。
(5) 普通倒置显微镜以及Hoechst 33342染色后荧光显微镜下观察60μM石斛酚单独给药、10μM顺铂单独给药、60μM石斛酚+10μM顺铂给药48 h时的MDA-MB-468人乳腺癌细胞的细胞形态以及细胞核状态。
(6)采用Annexin V-FITC/PI对细胞染色,流式细胞仪检测60μM石斛酚单独给药、10μM顺铂单独给药、60μM石斛酚+10顺铂给药48 h时的MDA-MB-468人乳腺癌细胞的细胞凋亡率。
(7)通过蛋白质印迹实验(Western blot)检测60μM石斛酚单独给药、10μM顺铂单独给药、60μM石斛酚+10μM顺铂给药48 h时的乳腺癌细胞凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase 9、Caspase 7、PARP、Cleaved-Caspase 9、Cleaved-Caspase 7、Cleaved-PARP的表达情况。
结果:(1)石斛酚作用于乳腺癌的潜在作用靶点共97个,GO分析结果表明潜在作用靶点主要是关于激酶活动,KEGG通路富集分析富集到最多靶点的信号通路是PI3K/Akt信号通路;通过分子对接,石斛酚3D结构可与PI3K、Akt以及下游的mTOR蛋白质3D结构的活性口袋进行对接。
(2) 石斛酚对MDA-MB-468人乳腺癌细胞、MCF-7的增殖抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性。
(3) 与单用顺铂相比,石斛酚与顺铂联用作用于MDA-MB-468人乳腺癌细胞和MCF-7细胞具有更强的增殖抑制能力。单用顺铂作用于MDA-MB-468人乳腺癌细胞48 h时的IC50为12.29μM,作用于MCF-7细胞48 h的IC50为22.66μM。与40、60μM石斛酚联用后,顺铂对MDA-MB-468人乳腺癌细胞48 h的IC50显著下降至3.73和2.92μM,在与20、40、60μM石斛酚联用后,顺铂对MCF-7细胞48 h的IC50则显著下降至19.62、17.12和8.36μM。
(4)与单用顺铂组相比,(40、60μM)石斛酚显著增强了顺铂诱导的MDA-MB-468人乳腺癌细胞和MCF-7细胞集落数量减少的能力。
参考文献
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[5]黄嘉惠.石斛酚对顺铂诱导乳腺癌细胞凋亡的作用及其机制研究[D].广州中医药大学,2022.