背景[1-3]
肺成纤维细胞是肺组织中的重要细胞成分。它们具有合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和其他细胞外基质的能力，对维持肺组织的结构和功能起着关键作用。
在生理条件下，肺成纤维细胞的主要功能是构造和维持肺脏的正常形态，合成和释放细胞外基质，为肺组织和细胞的高效交换气体提供物质基础，构成肺组织的主要支架，维持肺上皮和内皮细胞正常生理作用，以及组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。
然而，在病理条件下，如肺纤维化等疾病中，肺成纤维细胞的功能可能会发生异常，导致过度增殖和分泌细胞外基质，最终形成肺纤维化的病理改变。
因此，研究肺成纤维细胞的功能和调控机制对于深入了解肺组织的生理和病理过程，以及开发新的治疗方法具有重要意义。在实验研究中，肺成纤维细胞也常被用作细胞模型，以评估新药物或治疗方法对肺组织的影响。
Pulmonary Fibroblasts Cells(肺成纤维细胞)
肺成纤维细胞培养操作
1)复苏肺成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)肺成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)肺成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
肺成纤维细胞可以用于矽肺发病中外泌体miR-107对肺成纤维细胞转分化的作用及其机制
探讨巨噬细胞外泌体中miRNA对Pulmonary Fibroblasts Cells(肺成纤维细胞)转分化中的介导效应、可能的靶点与信号传导通路,进一步揭示其确切调控机制,为拓展对矽肺发病机制的阐释提供新的思路,也为进一步研发潜在的矽肺生物标志和干预靶点提供参考依据。
方法1.矽肺患者血清外泌体miRNAs检测及靶基因预测1.1研究对象以矽肺患者50例为病例组,无接尘史健康者50例为对照组。收集研究对象基线资料,采集静脉外周血、分离血清。1.2血清外泌体提取方法筛选分别采用超速离心法、30%蔗糖垫法、8%PEG+wash法、8%PEG+5%PEG法及试剂盒法提取血清外泌体,通过透射电子显微镜观察、纳米颗粒追踪分析、Western blot检测三种方法对外泌体进行鉴定,并比较外泌体的得率及纯度,确定最适方法。1.3矽肺患者血清外泌体miRNAs水平检测提取研究对象血清中外泌体miRNA,RT-qPCR检测miR-27b-5p、miR-30c-2-3p、miR-107、miR-122-5p、miR-125a-5p、miR-126-5p、miR-335-5p的水平。1.4 miRNAs靶基因预测利用miRWalk网站对检测出的差异miRNAs进行靶基因预测和筛选。
2. 矽肺小鼠肺成纤维细胞中外泌体miR-107水平时序分布规律及其作用观察2.1矽肺小鼠模型建立将50只C57BL/6N小鼠随机分为SiO2组和对照组,每组25只。采用非暴露式SiO2粉尘气管滴注法建立矽肺小鼠模型,染尘后1、7、14、28、56天分批处死小鼠,每次每组5只,收集外周血及肺组织。HE、Masson染色观察小鼠肺脏病理改变,Western blot检测纤维化标志α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin及CDK6表达以鉴定模型建立情况。2.2矽肺小鼠血清外泌体、肺组织中miR-107水平检测RT-qPCR检测小鼠血清外泌体、肺组织中miR-107水平以观察其在矽肺发生发展中的分布特点,并分析两者相关性。2.3矽肺小鼠发病中miR-107的干预效应观察人工合成miR-107抑制剂antagomir进行干预观察。20只小鼠随机分为SiO2+anta-miR组、SiO2+anta-NC组、SiO2组及对照组,每组5只,于染尘后28天处死,观察其肺脏病理改变,检测肺组织中miR-107水平及相关蛋白表达水平,原位杂交与免疫荧光共染观察miR-107及CollagenⅠ水平。
3.染尘巨噬细胞外泌体中miR-107对肺成纤维细胞转分化的激活作用及其机制研究3.1染尘巨噬细胞来源外泌体的提取和鉴定以SiO2粉尘刺激小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),设立对照组,分别提取其外泌体并鉴定。3.2染尘巨噬细胞外泌体及其所含miR-107对肺成纤维细胞转分化的激活作用观察RAW264.7细胞培养稳定后,提取其外泌体与小鼠胚肺成纤维细胞Pulmonary Fibroblasts Cells共孵育,激光共聚焦显微镜观察NIH-3T3细胞摄取外泌体情况,检测RAW264.7细胞及其外泌体与NIH-3T3细胞中miR-107水平。检测NIH-3T3细胞转分化标志α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin及CDK6蛋白表达水平。将miR-107人工合成模拟物(mimic)及其阴性对照(negativecontrol,NC)分别转染RAW264.7细胞,分离外泌体、检测其miR-107水平。将外泌体分别作用于NIH-3T3细胞,检测其转分化相关标志及CDK6蛋白表达水平。3.3 miR-107在转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)诱导的肺成纤维细胞转分化中的激活作用机制研究双荧光素酶基因报告验证miR-107～CDK6靶关系:将CDK6-3’UTR野生型和突变型质粒分别转染至293T细胞中,比较不同水平miR-107所致报告基因表达的改变,判断miR-107对CDK6是否具有抑制作用,以验证其靶向关系。
参考文献
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[3]Endothelial replicative senescence delayed by the inhibition of MTORC1 signaling involves MicroRNA-107[J].Eng-Soon Khor;;Pooi-Fong Wong.International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2018
[4]Time-course expression profile and diagnostic potential of a miRNA panel in exosomes and total serum in acute liver injury[J].Tarek K.Motawi;;Mohamed R.Mohamed;;Nancy N.Shahin;;Mohamed A.M.Ali;;May A.Azzam.International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2018
[5]王迪.矽肺发病中外泌体miR-107对肺成纤维细胞转分化的作用及其机制[D].郑州大学,2021.