背景[1-3]
GES-1细胞系是通过原代培养的胎儿正常胃粘膜上皮细胞用SV40病毒感染后得到的，经过3周左右的时间分离出了转化细胞克隆，并建立了可在体外长期稳定传代的细胞系。这种细胞系的基因组中整合了SV40T基因，并在细胞核中表达。GES-1人胃粘膜细胞具有转化特性，但其基本保留了正常的细胞骨架结构，如微丝、微管和角蛋白，且粘蛋白反应呈阳性。接种在裸鼠中6个月观察无致瘤性，因此可为深入研究胃上皮细胞癌变提供重要的模式系统。
GES-1
GES-1细胞系培养操作
1)复苏GES-1细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)GES-1细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)GES-1细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
GES-1细胞系可以用于基于TLR4-ACE2轴研究铁死亡在幽门螺杆菌感染致病中的作用及机制
通过体内外实验系统研究了H.pylori感染对铁死亡的影响及铁死亡与HMGB1/TLR4在H.pylori感染过程中的关系,并基于此进一步探索ACE2在H.pylori感染致病中的作用及机制,为H.pylori相关胃黏膜疾病的防治提供新的治疗靶点。
材料方法:(一)H.pylori体内外感染对铁死亡的影响1.H.pylori感染诱导胃上皮细胞发生铁死亡:通过H.pylori感染GES-1及AGS的细胞模型观察铁死亡相关表型的变化,如透射电镜观察H.pylori感染的胃上皮细胞超微结构变化、检测细胞ROS水平、细胞线粒体膜电位、胞内二价铁离子含量、细胞内谷胱甘肽(GSH)含量及丙二醛(MDA)水平变化。此外,通过Western blot检测H.pylori感染胃上皮细胞内铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11及COX2的表达变化。
2.H.pylori感染C57BL/6小鼠的模型鉴定:通过荧光原位杂交检测H.pylori在小鼠胃黏膜组织中的定植情况,H&E染色检测H.pylori感染小鼠胃黏膜组织病理变化。
3.H.pylori感染诱导小鼠胃黏膜细胞发生铁死亡:检测H.pylori感染小鼠胃黏膜组织ROS水平、线粒体膜电位的变化、胞内二价铁离子含量变化以及铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11及COX2的表达变化。
H.pylori感染诱导的胃上皮细胞铁死亡与TLR4信号相互调控并介导炎症反应1.铁死亡诱导剂及抑制剂处理对TLR4信号通路及炎症因子的影响:用铁死亡诱导剂(Erastin、RSL3)及抑制剂(Fer-1、DFO)处理GES-1及AGS细胞后与H.pylori共培养,通过Western blot检测铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11及HMGB1、TLR4的表达变化,并通过荧光定量PCR检测HMGB1、TLR4及下游分子My D88、TRAF3、IRAK4、IRAK1、TAK1、TRAF6以及相关促炎细胞因子的表达变化。
2.调控TLR4对铁死亡及促炎细胞因子的影响:TLR4抑制剂(TAK-242)处理GES-1及AGS细胞后与H.pylori共培养,检测细胞ROS水平、线粒体膜电位、胞内二价铁离子含量变化,通过Western blot检测TLR4及铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11的表达变化,并通过荧光定量PCR检测促炎细胞因子的表达变化。
H.pylori感染诱导的铁死亡通过TLR4信号通路上调ACE2表达1.H.pylori体内外感染对ACE2表达的影响:(1)构建H.pylori感染GES-1及AGS的细胞模型和H.pylori感染的小鼠模型,通过Western blot(细胞)及免疫组织化学染色(IHC)(胃黏膜)检测H.pylori感染及未感染细胞和小鼠胃黏膜组织中ACE2蛋白的表达;(2)收集临床不同病变阶段(轻度非萎缩性胃炎、重度非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生及胃癌)胃黏膜,用IHC检测ACE2表达情况,并分析其与H.pylori感染的关系。
2.铁死亡对ACE2表达的影响:下载TCGA数据库中胃癌数据进行批量相关性分析,选取与ACE2基因相关性系数绝对值前500个基因进行富集分析;将HIF-1α敲减和ROS清除剂(NAC)、铁死亡诱导剂及抑制剂预处理的胃上皮细胞(GES-1和AGS)与H.pylori共培养,观察铁死亡相关蛋白及ACE2的表达变化。
3.TLR4信号通路与ACE2的相关性分析:利用GEPIA数据库,纳入胃癌样本和正常胃黏膜组织样本,对TLR4信号通路(HMGB1、TLR4、My D88、TRAF3、IRAK4、IRAK1、TAK1、TRAF6)及ACE2的表达进行相关性分析。
参考文献
[1]Neutrophil-like cell membrane-coated siRNA of lncRNA AABR07017145.1 therapy for cardiac hypertrophy via inhibiting ferroptosis of CMECs[J].Shi Pilong;Li Minghui;Song Chao;Qi Hanping;Ba Lina;Cao Yonggang;Zhang Meitian;Xie Yawen;Ren Jing;Wu Jiabi;Ren Ping;Sun Hongli.Molecular Therapy-Nucleic Acids,2022
[2]A human pluripotent stem cell-based model of SARS-CoV-2 infection reveals an ACE2-independent inflammatory activation of vascular endothelial cells through TLR4[J].Ma Zhangjing;Li Xisheng;Fan Rebecca L.Y.;Yang Kevin Y.;Ng Calvin S.H.;Lau Rainbow W.H.;Wong Randolph H.L.;Ng Kevin K.;Wang Chi Chiu;Ye Peng;Fu Zelong;Chin Alex W.H.;Lai M.Y.Alison;Huang Yu;Tian Xiao Yu;Poon Leo L.M.;Lui Kathy O..Stem Cell Reports,2022
[3]Ferroptosis in cancer therapy:a novel approach to reversing drug resistance[J].Zhang Chen;Liu Xinyin;Jin Shidai;Chen Yi;Guo Renhua.Molecular Cancer,2022
[4]ACSL4 deficiency confers protection against ferroptosis-mediated acute kidney injury[J].Wang Yue;Zhang Menghan;Bi Ran;Su Yali;Quan Fei;Lin Yanting;Yue Chongxiu;Cui Xinmeng;Zhao Qixiang;Liu Siliang;Yang Yong;Zhang Dayong;Cao Qiuhua;Gao Xinghua.Redox Biology,2022
[5]王欢.基于TLR4-ACE2轴研究铁死亡在幽门螺杆菌感染致病中的作用及机制[D].南昌大学,2023.