背景[1-3]
NP-40裂解液是一种用于细胞组织裂解的试剂，主要成分为50mM Tris（pH7.4）、150mM NaCl、1%NP-40，以及其他一些抑制剂，如sodium pyrophosphate、β-glycerophosphate、sodium orthovanadate、sodium fluoride、EDTA和leupeptin等。这些成分共同作用，可以有效抑制蛋白降解，从而保护蛋白质的完整性和活性。
NP-40是一种非离子型去垢剂，具有两亲结构，能够破坏细胞膜，但对核膜的破坏作用较弱。因此，NP-40裂解液在裂解细胞时，能够提取胞浆蛋白，同时保留部分核蛋白。此外，NP-40与蛋白结合力强，能够防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。
NP-40裂解液
由于NP-40裂解液的性质较为温和，因此它常被用于需要保持蛋白质功能完整的实验，如Western blot、免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（co-IP）、染色质免疫共沉淀（ChIP）和酶活力测定等。同时，由于其含有较高浓度的去垢剂，不能使用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度，但可以使用其他方法，如BCA蛋白浓度测定试剂盒来测定蛋白浓度。
在使用NP-40裂解液时，需要注意适当分装后使用，并遵循产品说明书中的操作规范。同时，由于裂解液中的成分可能对某些实验产生干扰，因此在使用前需要充分了解和评估其对实验结果的影响。
应用[4-5]
NP-40裂解液可以用于FBXL16通过促进LATS1/2的泛素化抑制Hippo信号通路进而促进乳腺癌细胞的生物学行为
FBXL16(F-box and leucine-rich repeat protein 16)是F-box蛋白家族的成员之一,目前,FBXL16在恶性肿瘤中的作用还研究甚少,基因表达谱数据动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库结果显示,与正常乳腺组织相比,FBXL16在乳腺癌组织中高表达,且与FBXL16高表达者相比,FBXL16低表达组乳腺癌患者生存率升高。Genemania,Hitpredict等网站均预测FBXL16可能与LATS2之间存在蛋白质互作关系,且置信度较高,而LATS2激酶及其同源物LATS1是Hippo信号通路的关键调节因子,因此我们提出假说FBXL16能否通过与LATS1/2的相互作用,调控它们在乳腺癌细胞中的表达,进而调节Hippo信号通路活性,影响乳腺癌细胞的生物学行为,为乳腺癌的治疗提供新的靶点。
细胞蛋白提取实验,转染或干扰48h后,收取细胞沉淀。总蛋白提取加入NP-40裂解液(该裂解液中已提前加入蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂,比例为100:1:1),冰上裂解30分钟,使用低温(4℃)高速离心机以12000rpm的速率离心20分钟,所得上清即为总蛋白。在每20μl细胞沉淀物中加入200μl添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A,涡旋5秒,使细胞沉淀分散,冰浴10分钟,加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10μl,涡旋5秒,冰浴1分钟,涡旋5秒,低温(4℃)高速离心机以12000rpm的速率离心5分钟,所得上清即为浆蛋白。将上述沉淀用滤纸完全吸尽残余上清,加入50μl添加了PMSF的细胞核蛋白提取试剂,涡旋至细胞沉淀完全分散开,放入冰浴中,每隔1-2分钟涡旋15-30秒,共30分钟,低温(4℃)高速离心机以12000rpm的速率离心10分钟,所得上清即为核蛋白。
为了明确FBXL16与LATS1、LATS2的相互作用关系以及FBXL16对LATS1、LATS2泛素化水平的影响,我们进行了免疫共沉淀实验,收取总蛋白,每组蛋白裂解液中加入20μl混匀的Protein A+G磁珠,4℃旋转摇床上孵育2小时封闭处理,吸取上清。每1mg蛋白中加入1μg特异性一抗或相同属性的Ig G抗体,4℃旋转摇床上孵育过夜。18-24小时后加入Protein A+G磁珠,4℃旋转摇床上孵育4-6小时,低温(4℃)离心机以1000rpm速率离心10分钟,弃除上清,用NP-40裂解液将沉淀清洗三次,所得免疫复合物中加入相同体积的2×SDS loading缓冲液使其终浓度为1×,沸水煮10分钟使蛋白充分变性,进行Western blot检测。
参考文献
[1]Suppression of breast cancer progression by FBXL16 via oxygen-independent regulation of HIF1αstability[J].Kim Yeon-Ju;Zhao Yi;Myung Jae Kyung;Yi Joo Mi;Kim Min-Jung;Lee Su-Jae.Cell Reports,2021
[2]FBXL16 modulates the proliferation and autophagy in breast cancer cells via activating SRC-3-AKT signaling pathway[J].Yang Mei;Jing Fei.Reproductive Biology,2021
[3]Downregulated F-Box/LRR-Repeat Protein 7 Facilitates Pancreatic Cancer Metastasis by Regulating Snail1 for Proteasomal Degradation[J].Tang Liang;Ji Meng;Liang Xing;Chen Danlei;Liu Anan;Yang Guang;Shi Ligang;Fu Zhiping;Shao Chenghao.Frontiers in Genetics,2021
[4]The FBXL family of F-box proteins:variations on a theme.[J].Mason Bethany;Laman Heike.Open biology,2020
[5]孙明芳.FBXL16通过促进LATS1/2的泛素化抑制Hippo信号通路进而促进乳腺癌细胞的生物学行为[D].中国医科大学,2023.