背景[1-3]
GM130抗体是针对GM130的特异性抗体，主要用于研究GM130蛋白在生物体内的功能和表达。GM130是一种位于高尔基体（GA）顺式表面的高尔基体蛋白，是高尔基体的经典标志物。该蛋白与高尔基体膜紧密结合，参与维持高尔基体的结构完整性和囊泡转运。
GM130蛋白是一种位于高尔基体顺式表面的基质蛋白，它与高尔基体膜紧密结合，参与维持高尔基体的结构完整性和囊泡转运。GM130蛋白与p115、giantin、GRASP65和Rab GTPases等高尔基体相关蛋白相互作用，共同维持高尔基体的正常功能，如控制糖基化、参与膜泡运输等。
GM130抗体
而GM130抗体则是一种针对GM130蛋白的特异性抗体，它可以在实验室中用于检测GM130蛋白在细胞中的表达、定位和与其他蛋白的相互作用等。
GM130抗体在研究中有多方面的应用，例如免疫印迹、间接免疫荧光、免疫沉淀和免疫组化等。这些技术可以用于检测GM130蛋白在细胞中的表达、定位和与其他蛋白的相互作用等。
此外，GM130抗体也被用于研究GM130在特定疾病中的作用。例如，有研究表明GM130在神经系统疾病中发挥作用，并且其缺失不会损害小鼠的卵母细胞减数分裂和胚胎发育。另外，中科院遗传与发育生物学研究所、济宁医学院、安徽大学的相关研究人员在《Science China Life Sciences》上发表的研究论文揭示了GM130在调节II型肺泡细胞中肺表面活性蛋白质的分泌过程中的重要作用。
应用[4][5]
GM130抗体可以用于顺式高尔基体基质蛋白GM130影响小鼠卵母细胞纺缍体组装及不对称分裂的研究
确定GM130对小鼠卵母细胞纺缍体组装的影响。
[研究方法]卵子的收集和培养本实验采用4-6周龄ICR品系雌性小鼠,断颈法快速处死小鼠后取出卵巢,盛于一次性培养皿中,用刀片将卵巢剁碎,释放出来停留在第一次减数分裂间期的未成熟卵母细胞。只将那些处于GV期的未成熟卵母细胞置于转移至M2培养滴中,清洗5-6次后,移至覆盖有矿物油的M2培养滴或者含有2.5μM milrinone的M2培养滴,置于培养箱中培养(37℃,5%CO2,95%湿度)。培养到不同时期后取出用GM130抗体的于免疫印迹,免疫荧光及药物处理。
GM130抗体免疫荧光及激光共聚焦显微镜检测卵母细胞放入含4%多聚甲醛的PBS中室温30分钟。在室温下0.5%TritonX-100透膜20分钟,卵母细胞采用添加1%BSA的PBS封闭1小时,然后加入1：100的鼠抗GM130抗体,1：200的兔抗P—MEK1/2抗体,1：200兔抗a-tubulin抗体或1:100 anti-a-tubulin-FITC抗体放入4℃冰箱过夜。第二天采用含0.1%Tween 20和0.01%Triton X-100的PBS中洗三次,每次5分钟。卵母细胞在室温下标记上1：100的FITC/TRICT/CY5羊抗兔IgG,或1：100的FITC/TRICT/CY5羊抗鼠IgG 1小时。之后采用HOE或PI标记8—15分钟,再洗三次。
最后卵母细胞移到载玻片上采用激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM 510 META)检测。每组实验最少重复三次,每组至少检测50个卵母细胞。GM130抗体免疫印迹收集待检测的卵子约200个,加入等体积2×SDS loading buffer置于沸水中5分钟,冰上冷却后瞬时离心,存于冰上或-20℃。微量进样器上样,恒压90V电泳至样品位于浓缩胶边缘,改为恒压120V电泳2.5小时；4℃条件下转膜,恒流200mA 2.5小时,蛋白转至硝酸纤维素膜；TBS(20mM Tris,137mM NaCl,pH7.4)清洗膜三次,每次10分钟；膜转至封闭液中(5%脱脂奶粉/TBST)室温放置1.5小时；TBST(10mM Tris,150mM NaCl,0.05%Tween 20,pH7.5)清洗三次,每次10分钟；膜移至封闭液稀释的一抗（GM130抗体）中4℃放置过夜；TBST清洗三次,每次10分钟；膜移至封闭液稀释的二抗中37℃放置1小时；TBST清洗三次,每次10分钟；SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate kit(Thermo)检测信号。重复标记时,膜移至洗脱液(p-mercaptoethanol 14.3M,2%SDS,62.5mM Tris,pH6.7)中50℃放置30分钟,依照上述方法重新与相应的一抗、二抗孵育。
本实验涉及到的抗体采用的效价如下：鼠抗GM130抗体1：1000,鼠抗Myc 1：1000,鼠抗P-actin 1:1000,抗鼠IgG 1：1000。Nocodazole处理卵子用M2培养基稀释Nocodazole至20μg/ml,待卵子发育至特定时期后,移至含Nocodazole的M2培养滴,于培养箱中处理10分钟。处理之后,将卵母细胞彻底洗净用于免疫荧光实验。对照组中卵母细胞用相同浓度的DMSO进行处理。Morpholino注射Morpholino是经过修饰的人工合成反义寡核苷酸链小分子,与目的基因的mRNA或/和DNA结合,特异性抑制基因的转录或/和翻译,可作为研究基因功能的小分子工具。本实验所用的morpholino购自GENE TOOLS公司,GM130-morpholino序列信息如下：5’-GGGCCACATCACCACGATCCCGGCA-3’;Control-morpholino序列信息如下：5’-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3’。用Sigma水稀释,工作浓度为2mM和4mM。注射5-10pl的2mM MO后卵母细胞在含2.5μM的Milrinone中培养21小时。新鲜M2培养液中洗5遍,移到新鲜M2培养液中继续培养8小时和12小时,收集这两个时段的卵母细胞固定后做荧光免疫共聚焦试验。
[结果]小鼠卵母细胞减数分裂过程中GM130的表达和亚细胞定位体外培养小鼠卵母细胞0小时、2小时、8小时、12小时分别对应其发育的GV、GVBD、MⅠ、MⅡ期,用免疫印迹法半定量检测其表达水平。GM130抗体结果显示在小鼠卵母细胞发育的各个时期均有GM130的表达。为了检测GM130在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位我们采用了GM130抗体免疫荧光法。在GV期GM130散在分布于胞浆,似乎在生发泡的周围稍有集中。生发泡破裂后,GM130在细胞中央部分聚集。MI前期,染色体排列成一条线之前,GM130就开始向纺缍体的两极集中了。到了第一次减数分裂中期(MI),可以明显地看到GM130主要聚集在纺缍体的两极。当卵母细胞发育到了第一次减数分裂的后末期,GM130在中体的部位聚集。到了MII期,GM130又重新定位到纺缍体的两极,外形象月牙。
参考文献
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[5]张春晖.顺式高尔基体基质蛋白GM130影响小鼠卵母细胞纺缍体组装及不对称分裂的研究[D].南方医科大学,2012.