背景[1-3]
小鼠纤连蛋白(FN)Elisa试剂盒是一种用于检测小鼠血液、细胞培养上清或其他生物学样本中纤连蛋白（Fibronectin，FN）浓度的免疫学检测工具。纤连蛋白是一种大型的粘附性糖蛋白，参与细胞黏附、迁移、生长、分化以及组织修复等多种生理过程。
小鼠纤连蛋白(FN)Elisa试剂盒的主要成分包括酶标板、试剂、标准品等，通常以盒装液体的形式提供。实验过程中，需要先将纯化的小鼠新生甲状腺素抗体包被在微孔板上，制成固相抗体。然后，将待测样本加入到微孔中，样本中的FN会与固相抗体结合。接着，加入HRP标记的新生甲状腺素抗体，与已结合的FN形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤去除未结合的成分后，加入底物TMB进行显色反应。TMB在HRP酶的催化下会转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样本中的FN浓度成正比。最后，使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），并通过标准曲线计算样本中FN的浓度。
小鼠纤连蛋白(FN)Elisa试剂盒
小鼠纤连蛋白(FN)Elisa试剂盒操作步骤:
实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。
应用[4][5]
小鼠纤连蛋白(FN)Elisa试剂盒可以用于CircRTN4在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质沉积中的作用及机制
筛选并验证狼疮性肾炎系膜细胞中差异表达的circRNA,并探讨circRTN4在狼疮性肾炎系膜细胞增殖及ECM沉积中的作用及其调节纤连蛋白(fibronectin,FN)表达的确切机制。
方法:1.以人系膜细胞系为研究对象,3例LN患者置换血浆(LN plasma)和3例健康志愿者血浆(control plasma)为刺激物,收集细胞进行circRNA的芯片筛选,并通过real-time PCR、小鼠纤连蛋白(FN)Elisa试剂盒及RNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测circRTN4在LN系膜细胞中的表达。
2.收集狼疮性肾炎活检肾组织和因肾癌手术切除的远端正常肾组织,RNA FISH检测肾小球circRTN4的表达;免疫组织化学检测Cyclin D1和FN的表达。3.以人系膜细胞系为研究对象,检测狼疮性肾炎中circRTN4对肾小球系膜细胞增殖水平及ECM沉积的作用及机制:⑴根据circRTN4序列信息,设计3条si RNA并转染至HRMCs,real-time PCR检测敲低效率。⑵检测circRTN4对肾小球系膜细胞增殖和ECM沉积的影响:HRMCs随机分为四组:control plasma组、LN plasma组、LN plasma+sicircRTN4组、LN plasma+si NC组,Brd U掺入法检测系膜细胞增殖水平,real-time PCR、小鼠纤连蛋白(FN)Elisa试剂盒及western blot方法检测FN m RNA及蛋白的表达。⑶通过circ Base预测circRTN4的靶mi RNA,Target Scan预测与FN结合的mi RNA,二者取交集。选择可信度较高的3个mi RNA(mi R-607、mi R-647、mi R-513a-5p)构建mimic,系膜细胞中转染mi RNA mimics或过表达circRTN4,real-time PCR及western blot方法检测FN m RNA及蛋白的表达。
参考文献
[1]Lipid Alterations in Systemic Sclerosis[J].Gogulska Zuzanna;Smolenska Zaneta;Turyn Jacek;Mika Adriana;Zdrojewski Zbigniew.Frontiers in Molecular Biosciences,2021
[2]Tyrosine kinase nonreceptor 1(TNK1)knockdown ameliorates hemorrhage shock-induced kidney injury via inhibiting macrophage M1 polarization[J].Tang Miaolong;Cai Jimin;Wang Yan;Huan Zhirong;Yao Hao;Xu Ce;Ge Xin;Song Sheng.3 Biotech,2021
[3]Multiple Sclerosis-Minimizing Errors in Radiological Diagnosis[J].Boski Neha;Gulati Vaibhav;Raj Rohan;Gulati Parveen.Neurology India,2021
[4]Crosstalk between N6-methyladenosine modification and circular RNAs:current understanding and future directions[J].Wang Xin;Ma Rui;Zhang Xilin;Cui Lian;Ding Yangfeng;Shi Weimin;Guo Chunyuan;Shi Yuling.Molecular Cancer,2021
[5]苗心妍.CircRTN4在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质沉积中的作用及机制[D].河北医科大学,2023.