精氨酸是人体必需的氨基酸之一,是合成多肽的重要原料。由于精氨酸呈碱性及含有多个官能团,使得研究其性质及对多肽合成时不能直接使用,必须对其氨基和侧链胍基进行有效的保护,而pbf对酸最敏感,在TFA/H2O体系中常温就能方便的脱除,因此pbf是应用最为广泛的精氨酸保护基,因此,开发一种Fmoc-Pbf-精氨酸的检测方法具有重要的工业价值。
检测体系
醋酸酸性较三氟乙酸弱,且三氟乙酸一般禁用于质谱分析,因为三氟乙酸根信号很强,会掩盖几乎所有的负离子,甚至污染质量分析器。现有的方法是用三氟乙酸体系测Fmoc-Arg(pbf)-OH有关物质,TFA起到类似离子对的作用,一般浓度在0.05-0.1%,过高的浓度,会使溶液偏酸,长时间使用可能影响色谱柱寿命。研究人员用醋酸体系和三氟乙酸体系也做了对比,结论醋酸体系对检测Fmoc-Arg(pbf)-OH有关物质在分离度,以及保护色谱柱方面更有优势。
检测步骤
步骤一:将Fmoc-Arg(pbf)-OH和各杂质对照品Fmoc-Arg-OH,Fmoc-β-Ala-OH,Fmoc-β-Ala-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH分别溶于乙腈中,得到浓度分别为0.5mg/ml的样品溶液和杂质对照品溶液,以乙腈为空白溶液。
步骤二:吸取Fmoc-Arg(pbf)-OH溶液1ml,各杂质对照品溶液各1ml,形成混合溶液。
步骤三:采用ZORBAX ODS 4.6mmx250mm 5μ,设柱温35℃,波长220nm,进行梯度洗脱。
步骤四:进样顺序及进样量,先进步骤二的混合溶液10ul,然后再分别进每种单个杂质对照品溶液10ul,以便确定混合溶液出峰中对应的杂质出峰时间;
步骤五:进以乙腈为空白溶液1针,然后进Fmoc-Arg(pbf)-OH,通过面积归一法积分,得到纯度。
此方法提供的Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质检测方法,检测速度较快,结果准确,杂质分离度好,方法步骤简单,便于操作,具有广阔的应用前景。