背景[1-3]
SMAD5抗体是一种可以特异性结合SMAD5的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的SMAD5蛋白。SMAD5抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。
SMAD5，也称为MADH5和JV5-1，是一种由BMP（骨形态发生蛋白）1型受体激酶激活的转录调节剂。SMAD5是一种受体调节的SMAD（R-SMAD）。它在TGF-β抑制人造血祖细胞增殖的信号通路中起关键作用。
SMAD5抗体
SMAD5抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（SMAD5抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(SMAD5抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
SMAD5抗体可以用于BMPR2/SMAD5信号通路对鸡颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成的影响
以产蛋鸡的正常发育卵泡和就巢鸡的闭锁卵泡进行转录组测序,并筛选可能参与调控鸡卵泡发育的信号通路,然后在体外培养的鸡颗粒细胞中干扰和过表达该通路中上下游关键基因后检测对细胞增殖、凋亡以及类固醇激素合成的影响,并外源添加信号通路抑制剂后影响颗粒细胞的生长发育情况,以期明确信号通路在鸡卵泡颗粒细胞发育中的作用。
主要研究结果如下:(1)对产蛋鸡正常卵泡和就巢鸡的闭锁卵泡进行转录组测序后对比发现了200个表达差异显著的基因,其中有131个上调基因和69个下调基因,SMAD5抗体结果显示包括SMAD5与BMPR2。GO富集分析显示在生物过程中主要与细胞活化调节、淋巴细胞活化调节、白细胞活化的负调节和增殖关联密切;细胞组分中主要为中间丝细胞骨架、免疫突触等;分子功能主要为结合和催化活性。KEGG富集分析通路发现,差异基因富集到的前20个通路主要是TGF-β信号通路、细胞粘联分子(CAMs)等,其中TGF-β信号转导通路与卵泡的生长发育密切相关。
(2) 在体外培养的鸡原代颗粒细胞中干扰BMPR2表达后,显著提高了细胞增殖相关基因PCNA、CDK2以及CCND1的m RNA表达水平;CCK8试剂盒检测发现颗粒细胞增殖效率明显升高;Ed U染色显示阳性细胞数量显著增加;细胞中的凋亡相关因子(Caspase-3与Caspase-9)表达量显著降低;促进细胞中雌激素(E2)和孕酮(P4)的分泌以及相关基因CYP11A1和CYP19A1的表达,以上结果表明BMPR2可抑制鸡颗粒细胞增殖、促进细胞凋亡。
(3)SMAD5抗体结果显示在体外培养的鸡原代颗粒细胞中过表达SMAD5,细胞增殖基因PCNA、CDK2以及CCND1的m RNA表达量和蛋白水平表达量均显著降低,而凋亡相关基因Caspase-3与Caspase-9的表达量显著上升;CCK8与Ed U检测均显著细胞增殖效率显著降低,E4与P2的合成及其相关基因的m RNA表达量与蛋白水平表达量也显著下降。然而,在细胞中干扰SMAD5表达后,得到与上述相反的结果。以上结果表明SMAD5可抑制鸡卵泡颗粒细胞增殖、促进细胞凋亡。(4)在体外原代颗粒细胞中干扰BMPR2表达后SMAD5抗体结果发现SMAD5的表达量下降,可对BMP/SMAD信号通路造成抑制作用。
参考文献
[1]Vascular-Parenchymal Crosstalk Promotes Lung Fibrosis Through BMPR2 Signaling.[J].Yanagihara Toyoshi;Tsubouchi Kazuya;Zhou Quan;Chong Michael;Otsubo Kohei;Isshiki Takuma;Schupp Jonas C;Sato Seidai;Scallan Ciaran;Upagupta Chandak;Revill Spencer;Ayoub Anmar;Chong Sy Giin;DvorkinGheva Anna;Kaminski Naftali;Tikkanen Jussi;Keshavjee Shaf;ParéGuillaume;Guignabert Christophe;Ask Kjetil;Kolb Martin Rj.American journal of respiratory and critical care medicine.2023
[2]Expression Patterns and Gonadotropin Regulation of the TGF-βII Receptor(Bmpr2)during Ovarian Development in the Ricefield Eel Monopterus albus[J].He Zhi;Zheng Li;Chen Qiqi;Xiong Sen;He Zhide;Hu Jiaxiang;Ma Zhijun;Zhang Qian;He Jiayang;Ye Lijuan;He Liang;Luo Jie;Gu Xiaobin;Zhang Mingwang;Tang Ziting;Jiao Yuanyuan;Pu Yong;Xiong Jinxin;Gao Kuo;Lai Bolin;Yang Shiyong;Yang Deying;Yan Taiming.International Journal of Molecular Sciences.2022
[3]BMP/Smad Pathway Is Involved in Lithium Carbonate-Induced Neural-Tube Defects in Mice and Neural Stem Cells[J].Yang Aiyun;Li Shen;Zhang Yan;Wang Xiuwei;Guan Zhen;Zhu Zhiqiang;Liang Yingchao;Zhao Lijiao;Wang Jianhua.International Journal of Molecular Sciences.2022
[4]Leptin promotes primordial follicle activation by regulating ovarian insulin-like growth factor system in chicken.[J].Ahmadi Sadequllah;Ohkubo Takeshi.Endocrinology.2022
[5]王苏文.BMPR2/SMAD5信号通路对鸡颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成的影响[D].四川农业大学,2023.