背景[1-3]
PAK6抗体是一种特异性识别和结合转录因子PAK6的抗体。通过使用PAK6抗体，研究人员可以检测和定量PAK6在细胞或组织样品中的表达水平，进而了解其在相关生物过程中的功能和调控机制。常见的应用包括免疫印迹（Western blotting）、免疫组化（immunohistochemistry）和免疫荧光染色（immunofluorescence）等。
PAK6基因编码p21刺激的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一个成员，该激酶家族包含一个氨基末端Cdc42/Rac相互作用结合(CRIB)结构域和一个羧基末端激酶结构域。这些激酶在许多细胞过程中起作用，包括细胞骨架重排、细胞凋亡和丝裂原活化蛋白(MAP)激酶信号通路。由该基因编码的蛋白质与雄激素受体(AR)相互作用并转移到细胞核，参与转录调控。该基因表达的变化与前列腺癌有关。可变剪接导致多个转录本变体。
PAK6抗体
PAK6A抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（PAK6A抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(PAK6A抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
PAK6抗体可以用于AR、PAK6、P53在膀胱癌中的表达及相关性研究
雄激素受体(androgen receptor,AR)、P21活化激酶6(p21-activated kinase 6,PAK6)、P53基因与人类癌症密切相关,但其在膀胱癌中的生物学作用尚未完全展示。本研究旨在探讨AR、PAK6、P53在膀胱癌及膀胱正常粘膜组织中的表达及差异性;分析三者之间的关系,进一步揭示三者在膀胱癌发生、进展中的相互作用;探讨三者的表达与膀胱癌肿瘤数量、临床分期、病理分级、复发、转移等临床病理特征的关系;验证AR、PAK6、P53在膀胱癌中作为肿瘤分子标记物的潜在价值。
方法:(1)采用PAK6抗体免疫组化染色方法(Envision)检测膀胱癌组与膀胱正常粘膜组中AR、PAK6、P53蛋白阳性表达率。分析AR、PAK6、P53蛋白表达在膀胱癌中的临床病理特征,以及膀胱癌中AR与PAK6、P53蛋白之间的相关性。(2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测正常膀胱细胞株(SV-HUC-1)和两种膀胱癌细胞株(T24、BIU-87)中PAK6 m RNA的表达水平,构建PAK6过表达质粒。(3)采取瞬转法将构建好的PAK6过表达质粒转染至细胞中,即为PAK6过表达组(overexpression group,OE),转染空载质粒作为阴性对照组(negative control group,NC),用qPCR方法检测各组细胞的转染效率。(4)CCK-8、细胞划痕检测PAK6上调后对BIU-87膀胱癌细胞株增殖和迁移水平的影响。(5)qPCR方法检测PAK6上调后对BIU-87细胞株中AR m RNA、P53 m RNA的表达的影响。(6)PAK6抗体Western blotting法检测PAK6上调后对BIU-87细胞株中AR、P53蛋白表达量的影响。
结果:(1)通过PAK6抗体免疫组织化学法检测膀胱癌组中AR、PAK6、P53蛋白的阳性表达率分别为:78.1%(50/64)、45.5%(20/64)、70.3%(45/64),膀胱正常粘膜组中AR、PAK6、P53蛋白的阳性表达率分别为:25%(16/64)、84.4(54/64)、43.8%(28/64),差异均具有统计学意义(P<0.05),即AR、P53蛋白在膀胱癌组中的表达水平明显高于正常粘膜组,PAK6蛋白在膀胱癌组中的表达水平低于正常粘膜组。(2)AR蛋白的表达与膀胱癌病理分级、肿瘤分期、转移有关(P<0.05)。PAK6蛋白的表达与膀胱癌复发有关(P<0.05)。P53蛋白的表达与病理分级、肿瘤分期、复发及转移有关(P<0.05)。(3)对膀胱癌组织中AR、PAK6、P53蛋白的表达水平进行相关分析,AR蛋白与PAK6蛋白在膀胱癌中的表达呈现负相关(rb=-0.525,P<0.01),AR蛋白与P53蛋白在膀胱癌中的表达呈现负相关(rb=-0.711,P<0.01)。
参考文献
[1]Advances in Diagnosis and Therapy for Bladder Cancer[J].Hu Xinzi;Li Guangzhi;Wu Song.Cancers.2022
[2]p53 signaling in cancer progression and therapy.[J].Marei Hany E;Althani Asmaa;Afifi Nahla;Hasan Anwarul;Caceci Thomas;Pozzoli Giacomo;Morrione Andrea;Giordano Antonio;Cenciarelli Carlo.Cancer cell international.2021
[3]Bladder Cancer:Current Challenges and Future Directions[J].Dobruch Jakub;Oszczudłowski Maciej.Medicina.2021
[4]Loss of androgen receptor promotes HCC invasion and metastasis via activating circ-LNPEP/miR-532–3p/RAB9A signal under hypoxia[J].Ouyang Xiwu;Yao Lei;Liu Guodong;Liu Shiqing;Gong Liansheng;Xiao Yao.Biochemical and Biophysical Research Communications,2021
[5]梁聪聪.AR、PAK6、P53在膀胱癌中的表达及相关性研究[D].内蒙古医科大学,2023.