背景[1-3]
VAPB抗体是一种可以特异性结合VAPB的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的VAPB蛋白。VAPB抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。
VAPB基因编码的蛋白质是在血浆和细胞内囊泡膜中发现的IV型膜蛋白。发现编码的蛋白质是同源二聚体和与VAPA的异源二聚体。这种蛋白质还可以与VAMP1和VAMP2相互作用，并可能参与囊泡运输。
VAPB抗体
VAPB抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（VAPB抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(VAPB抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
VAPB抗体可以用于骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制研究
microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复:1.MTT方法检测了成骨细胞MC3T3和MG63细胞的增殖率,结果发现EVs的处理促进了细胞增殖。TUNEL染色结果显示,EV处理可抑制细胞凋亡;2.F-actin的免疫荧光染色观察了MC3T3和MG63细胞的细胞粘附,发现B-EV处理对细胞粘附无明显影响;3.人I型胶原蛋白(Human type I collagen,ColⅠ)的免疫荧光染色证明B-EVs促进ColⅠ表达,与茜素红染色结果一致。RT-q PCR和western blot分析验证B-EV处理可增加α-SMA、OCN、GDF-10和FGF-2的水平;4.RT-q PCR显示EVs-Inhibitor处理后miR-335表达明显下降,并伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加。而且,ALP、茜素红和ColⅠ免疫荧光染色发现,B-EVs携带的miR-335的干预部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用;5.囊泡相关膜蛋白(Vesicle associated membrane protein,Vapb)能促进破骨细胞的生长,因此我们重点研究了Vapb,HEK293T细胞中的双荧光素酶报告基因检测显示miR-335可以靶向Vapb;6.RT-q PCR和VAPB抗体western blot分析检测小鼠和细胞中Vapb水平。
结果显示,EV处理抑制了Vapb水平,而miR-335抑制可以缓解Vapb的抑制;7.miRwalk、Target Scan、EvimcrRNA和Starbase的网站上预测并筛选了miR-335的7个靶基因(SMARCA2、Vapb、NAA25、KLHL28、NUCKS1、RCC2和RBFOX2),通过文献调研,我们发现囊泡相关膜蛋白(Vesicle associated membrane protein,Vapb)能促进破骨细胞的生长。使用RT-PCR和western blot鉴定过表达Vapb细胞的构建情况,RT-q PCR显示,转染后细胞中Vapb mRNA的表达明显增加,使用VAPB抗体western blot在蛋白中观测到了相似结果;MTT检测细胞活力及TUNEL染色检测细胞凋亡的结果表明,过表达Vapb细胞的细胞伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加,表明Vapb过表达诱导细胞凋亡;Vapb过表达部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用。8.过表达Vapb可逆转EVs对Wnt和β-catenin蛋白表达的促进。提示EVs中靶向Vapb的miR-335可能与Wnt和β-catenin通路有关。
参考文献
[1]Synergistic anti-inflammatory and osteogenic n-HA/resveratrol/chitosan composite microspheres for osteoporotic bone regeneration[J].Li Limei;Yu Mali;Li Yao;Li Qing;Yang Hongcai;Zheng Meng;Han Yi;Lu Di;Lu Sheng;Gui Li.Bioactive Materials.2021
[2]A light-up fluorescence resonance energy transfer magnetic aptamer-sensor for ultra-sensitive lung cancer exosome detection.[J].Zhu Nanhang;Li Guohao;Zhou Juan;Zhang Yujia;Kang Ke;Ying Binwu;Yi Qiangying;Wu Yao.Journal of materials chemistry.B.2021
[3]Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal miR-25 Regulates the Ubiquitination and Degradation of Runx2 by SMURF1 to Promote Fracture Healing in Mice[J].Jiang Yikun;Zhang Jun;Li Zhengwei;Jia Guoliang.Frontiers in Medicine.2020
[4]Serum MicroRNA Differences Between Fracture in Postmenopausal Women with and without Diabetes.[J].Ren Cheng;Li Ming;Sun Liang;Li Zhong;Lu Yao;Wang Qian;Ma Teng;Xue HanZhong;Zhang Kun.Orthopaedic surgery.2020
[5]胡海峰.骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制研究[D].山西医科大学,2021.