细胞色素C又被称为血红素,是一种含铁卟咻基团的蛋白质,在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间。细胞色素C广泛存在于动物的需氧组织中,集中分布于动物心肌细胞质内的线粒体膜的外表面。它在生物氧化过程中是一个非常重要的电子传递体,可加速酶促作用的进行。
细胞色素C可以治疗哪些疾病?
细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂,其溶液可用于各种组织缺氧急救的辅助治疗,如一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。尤其在病情恶化抢救时,静脉注射细胞色素C有较好的效果。
细胞色素C的制备
细胞色素C易溶于水,对热、干燥、酸比较稳定,易提取。目前多以猪心为原料制备,其提取流程见下图:
样品(猪心)处理
(1)采用新鲜或冷冻猪心,除尽脂肪、血管和韧带,洗尽积血,切成小快,放入绞肉机中绞碎(两遍);
(2)称取猪心碎肉200克,加蒸馏水300毫升;
(3)用电磁搅拌器搅挫提取,再用1molL的硫酸调 PH=4.0,(需要不断调整)搅拌提取1.5小时。用1mol/L的氨水调PH=6.0,停止搅拌。
(4)四层纱布挤压过滤,收集滤液。
中和
用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5,静置20~30分钟,使沉淀沉下。过滤除杂质,下部浑浊液离心 (3000rpm,15min)。合并得到的红色清夜,测量体积。
吸附与洗脱
吸附:加10%人造沸石→磁力搅拌器搅拌吸附1h→蒸馏水洗3次→0.2%NaCI溶液洗3次→蒸馏水洗3次→滤出人造沸石待用;
洗脱:在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水→将沸石放入柱中→装满25%的硫酸铵溶液进行洗脱,流速控制在2ml/min以下,收集红色的洗脱液
盐析
为了进一步提纯细胞色素C,向洗脱液中缓慢加入固体硫酸,(即100ml洗脱液加17g硫酸按)边加边搅拌,放置30分钟,杂蛋白沉淀析出,过滤,收集红色透亮的细胞色素C滤液,测量体积。
TCA沉淀
按8%体积滴加TCA,边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷,与其结合生成可逆沉淀析出,立即离心(3000rpm,15min),收集沉淀(若上清液仍为红色,倒出后再补加5%体积的TCA,再次离心收集沉淀)。沉淀用少量去离子水溶解(体积不超过10mL)。
细胞色素C溶液的检测
细胞色素C溶液是一种深红色的澄清液体。以2020版《中国药典》为准则,其检测方法如下:
含铁量
标准铁溶液:取硫酸铁铵50g,加水300ml与硫酸6ml的混合溶液溶解后,加水适量使成1000ml,摇匀。精密量取25ml,置碘瓶中,加盐酸5ml,混合,加碘化钾试液12ml,密塞,静置10分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定,至近终点时,加淀粉指示液1ml,继续滴定至蓝色消失。每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于5.585mg的Fe。根据硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)消耗的量(ml),计算每1ml中含Fe量(mg)。精密量取适量,加硫酸稀释液(取稀硫酸2ml,用水稀释至500ml)制成每1ml中含23μg的Fe。
供试品溶液:精密量取本品适量(约相当于细胞色素C100mg),置10ml量瓶中,用水稀释至刻度。
测定法:精密量取供试品溶液5ml,置已炽灼至恒重的坩埚中,蒸干,在105℃干燥至恒重,精密称定重量W1,缓缓炽灼至完全炭化后,继续在500~600℃炽灼使完全灰化并恒重,精密称定重量W2。另精密量取供试品溶液1ml,置25ml量瓶中,加30%过氧化氢溶液0.7ml与稀硫酸0.5ml,置水浴中,加热30分钟,取出,放冷,精密加入联吡啶试液2ml,置冷水浴中,缓缓加入亚硫酸钠试液5ml,随加随振摇,置60~70℃水浴中,加热30分钟,取出,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,在522nm的波长处测定吸光度A1,另精密量取标准铁溶液2ml,置25ml量瓶中,照上述方法,自“加30%过氧化氢溶液0.7ml”起,依法操作,测定吸光度A2,按下式计算,
限度 :应为0.40%~0.46%。
含量测定
照紫外-可见分光光度法(通则0401)测定:
供试品溶液:精密量取含铁量项下的供试品溶液1ml,置50ml量瓶中,用磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠1.38g与磷酸氢二钠31.2g,加水适量使溶解并制成1000ml,调节pH值至7.3)稀释至刻度,加连二亚硫酸钠约15mg,摇匀。
测定法:取供试品溶液,在约550nm的波长处,以间隔0.5nm找出最大吸收波长,测定吸光度,按细胞色素C的吸收系数(E1%1CM)为23.0计算。
细胞色素C活力测定
取磷酸盐缓冲液(0.2mol/L)5ml、琥珀酸盐溶液1.0ml与供试品溶液0.5ml(如系还原型制剂,应加入0.01mol/L铁氰化钾溶液0.05ml),置25ml具塞比色管中,加去细胞色素C的心悬浮液0.5ml与氰化钾溶液1.0ml,加水稀释至10ml,摇匀,以同样的试剂作空白,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在550nm的波长处附近,间隔0.5nm找出最大吸收波长,并测定吸光度,直至吸光度不再增大为止,作为酶还原吸光度;然后各加连二亚硫酸钠约5mg,摇匀,放置约10分钟,在上述同一波长处测定吸光度,直至吸光度不再增大为止,作为化学还原吸光度;按下式计算: