背景[1-6]
RNA纯化试剂盒是用于纯化并回收体外转录得到的RNA分子和从各种材料中提取得到的总RNA，能有效地去除RNA样品中污染的杂质。本产品回收率可达80%，得到的RNA OD260/OD280比值一般为2.0左右，可以直接用于后续较敏感的实验（如微点阵分析、荧光RT-PCR等）。随着转录组学的不断深入，RNA的类型，表达调控以及功能的复杂程度远远超乎我们的想象。
去除含量占80%以上的核糖体RNA有助于将测序集中在含量少但信息大的RNA上。目前去除rRNA主要是通过探针和RNase H联合使用的方式，处理后的RNA会混杂很多消化产物，酶和离子，不利于后续RNA文库的构建。以柱式RNA纯化试剂盒为例Trizol是即用型的试剂，可用于从组织和细胞中纯化总RNA。这是一种含酚和异硫氰酸胍的单相溶液，便于裂解组织和细胞，抑制RNA酶以保持RNA完整性。
Trizol总RNA纯化试剂盒I结合了Trizol试剂盒硅胶膜技术，在20-40分钟内可从动物组织、培养细胞、血液和植物样本中分离RNA，与传统的Trizol沉淀法相比，残留的盐分和蛋白更少。核酸纯化柱可方便结合、洗涤和洗脱，因此可同时操作多个样本。
与传统的RNA分离技术不同，该柱无需异丙醇沉淀和乙醇洗涤等。样本被Trizol试剂裂解。加入氯仿后，匀浆物通过离心分为水相和有机相。RNA分离至上层水相，而DNA分离至中层，蛋白分离至下层有机相。含RNA的水相加入乙醇后转移至核酸纯化柱，RNA结合到硅胶膜上，溶解的蛋白与PCR抑制物则被过滤除去。RNA经Buffer WA和Buffer WBR洗涤液洗涤后，用RNase-Free Water洗脱得到纯化RNA。洗脱的RNA长度在200 bp和10 kb之间，其中以tRNA为主。纯化的RNA可直接用于RT-PCR、Northern blot、Dot blot、体外翻译、RNA酶保护分析等各种分子生物学实验，或保存于-70℃待后续使用。
特点：
可以回收20 nt以上的RNA；
操作简单快速，只需要5分钟；
回收率高达80%以上；
一站式，即开即用，操作简单，用户不需要自备任何试剂；
得到的RNA纯度高，可以用于各种后续实验。
应用[7][8]
RNA纯化试剂盒可用于各种样本RNA提取实验中的纯化：
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)也称为肽类抗生素(Peptideantibiotics)或天然抗生素(Natural antibiotics),是一类对细菌、真菌等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制作用的小分子多肽。研究抗菌肽为开发新的抗菌素、抗病毒和肿瘤抑制剂开辟了广阔的前景。本实验的目的旨在从银杏果仁中分离纯化出一种抗菌肽、对其性质进行研究,并建立从银杏种仁中反转录克隆cDNA的方法体系,为克隆基因和研究其抗菌机理奠定基础。
实验以银杏种仁为研究材料,以常压柱层析法、离心式离子交换层析加电洗法脱、AKTA柱层析法等三种方法从银杏种仁中提取出一种抗菌肽,并对其纯度、分子量、抗菌活性、热稳定性、对极端pH值的抗性、对高盐浓度的抗性等性质进行了分析。通过异硫氰酸胍法、TRIzoL法,CTAB法以及SDS法分别提取银杏种仁的总RNA,建立反转录体系。主要获得以下结果:1、三种方法纯化出银杏种仁抗菌肽,此蛋白在SDS-PAGE上显示单条带,表观分子量为13000Da。AKTA柱层析法所得蛋白在双向电泳中达
到单点纯。2、该蛋白在离子交换层析中以高盐浓度被洗脱,是一种碱性蛋白。对照其双向电泳图谱,其等电点在9.8左右。3、纯化的蛋白对黄瓜镰刀孢菌(Fusarium oxysporum)辣、椒早疫病菌(Alternariasolani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinereaPers)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)等14种真菌有抑制作用。4、该蛋白浓度达到2.5mg/ml以上即表现出明显的抑菌活性。具有较高热稳定性,在90℃处理30min对黄瓜镰刀孢菌抑菌活性无明显变化。在酸性条件下,对供试的黄瓜镰刀孢菌有很强的抑菌活性。对革兰氏阳性菌代表菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌代表菌大肠杆菌均有一定的抑制作用。5、CTAB法提取得总RNA纯度高,完整性好,可用于反转录试验。
参考文献
[1]Antifungal proteins:targets,mechanisms and prospective applications[J].T.Theis,U.Stahl.Cellular and Molecular Life Sciences.2004(4)
[2]A novel procedure for separating small peptides on polyacrylamide gels[J].Kwabena Sarfo,Greg B.G.Moorhead,Raymond J.Turner.Letters in Peptide Science.2003(2)
[3]A method for isolating total RNA from pear leaves[J].M.Malnoy,J.P.Reynoird,F.Mourgues,E.Chevreau,P.Simoneau.Plant Molecular Biology Reporter.2001(1)
[4]A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J].Evi Kiefer,Werner Heller,Dieter Ernst.Plant Molecular Biology Reporter.2000(1)
[5]A simple procedure for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit[J].Mehar H.Asif,Puneet Dhawan,Pravendra Nath.Plant Molecular Biology Reporter.2000(2)
[6]Characterization and cDNA cloning of two glycine-and histidine-rich antimicrobial peptides from the roots of shepherd’s purse,Capsella bursa-pastoris[J].Chong Jing Park,Chan Bae Park,Seung-Suh Hong,Hyun-Soo Lee,Sang Yeol Lee,Sun Chang Kim.Plant Molecular Biology.2000(2)
[7]An Improved RNA Isolation Method for Plant Tissues Containing High Levels of Phenolic Compounds or Carbohydrates[J].R.A.Salzman,T.Fujita,K.Zhu-Salzman,P.M.Hasegawa,R.A.Bressan.Plant Molecular Biology Reporter.1999(1)
[8]荆贝贝.银杏种仁抗菌肽的分离纯化、性质鉴定及其总RNA提取[D].西北农林科技大学,2006.