背景及概述[1][2]
肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase,E.C.1.5.3.1)简称SOX,是肌酐降解代谢途径中的第三个酶,能专一性地催化底物肌氨酸生成甘氨酸。微生物是肌氨酸氧化酶最为主要的来源,其在临床诊断中有广泛的应用,通过肌氨酸氧化酶偶联肌酐酶、肌酸酶测定血清中肌酐的含量,是判断肾脏功能的一个重要参考指标,在医药领域具有良好的应用前景。
制备[1]
一种制备肌氨酸氧化酶的方法。 这种方法的原理主要在于:将优化后的肌氨酸氧化酶编码基因插入构建好的表达载体,在大肠杆菌中诱导其高效表达,该方法具体为:
1.肌氨酸氧化酶表达载体的构建:
通过基因工程手段利用NdeI和Xho I位点将其克隆至PRSF Duet载体内, 并转化大肠杆菌TOP10菌株,挑取数个转化克隆提取质粒,通过限制性内切酶 酶切鉴定目的基因是否插入载体(图1所示),选取插入目的基因的质粒进行 DNA序列测定,结果表明肌氨酸氧化酶基因成功克隆至pRSF Duet载体内,将其命名为SAO pRSF。
2.肌氨酸氧化酶的表达:
1)以BL21(DE3)为宿主菌,将SAO pRSF进行转化,挑取单菌落于3ml LB培养基培养过夜;
2)以1∶500比例将菌液转接至400ml LB培养基,恒温在37℃,230rpm培 养至OD600=0.4‑0.6;
3)加IPTG诱导,IPTG诱导终浓度为0.5mM,保持25℃条件下表达8小 时后收菌。
BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如 pET系列)的基因。普通大肠杆菌没有t7 RNA聚合酶,所以不能表达那些载体 上的基因。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶,该区整合于BL21的 染色体上,就叫BL21(DE3)。
3.肌氨酸氧化酶的纯化:
1)取400ml培养液3000rpm离心分离10分钟后收集菌体,菌体重悬于 10ml蛋白提取缓冲液中(50mM Na‑PO4,pH8.0,500mM NaCl,10mMImidazle), 15MPa高压破菌,12,000rpm,4℃离心10min,上清液与Ni‑NTA冰上孵育1小 时;
2)过Ni‑NTA亲和层析柱,用蛋白提取buffer洗涤,最后用250mM Imidazle 洗脱,收集洗脱液。
3)蛋白洗脱液过G50柱去除Imidazle,这样可以得到95%以上纯度的 SAO(图2所示)。
4.肌氨酸氧化酶活性测定:
制备肌氨酸氧化酶的纯品用奥林巴斯AU5400生化仪测定活性,酶活可达 30000U/L,且‑20℃甘油冻存6个月,酶活基本保持不变。
上述制备肌氨酸氧化酶的方法可作为诊断试剂,用于肌氨酸检测试剂盒的 研制。
提高稳定性[2]
由于肌氨酸氧化酶在保存、运输过程中易失活,因此提高其稳定性是该酶大量应用的基础。目前,提高酶稳定性方法主要有,蛋白质工程、固定化、添加保护剂、化学修饰等,其中固定化是较为常用的方法。戊二醛作为双功能试剂,广泛应用于酶固定化中,但考虑到操作复杂且试剂具有毒性,CN201310301117.9中使用碳二亚胺法固定肌氨酸氧化酶,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是一种将氨基和羧基偶联的缩合剂,酶分子羧基被碳二亚胺活化,生成中间产物,该产物再与氨基载体反应形成结合物。
CN201310301117.9提供一种提高肌氨酸氧化酶稳定性的方法,以多聚赖氨酸poly-lysine为氨基载体,选用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC为交联剂,对肌氨酸氧化酶进行固定化处理,固定化条件为:酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:10-80,酶分子表面羧基与EDC摩尔比为1:1-2,固定化pH为6.5-8.0,固定化温度为4-10℃,50 r/min固定化时间为16-20h。
优选的固定化条件为:酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:50,固定化pH为6.5。
在固定化之前需要研究肌氨酸氧化酶分子表面酸性氨基酸数目,所述单个肌氨酸氧化酶分子表面酸性氨基酸数目为49个。
较佳地,固定化处理以多聚赖氨酸为氨基载体。
较佳地,氨基载体的氨基密度为27mol/g。
较佳地,所述酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:50,酶分子表面羧基与EDC摩尔比为1:2,所述固定化pH为6.5。
应用[3]
CN201611080806.1涉及一种用于肌氨酸的电化学检测方法,包括:利用物理吸附或者化学偶联的方法将肌氨酸氧化酶和核酸序列连接;将过氧化物酶和第二核酸序列连接;提供核酸纳米结构,其上伸出识别序列;提供第二核酸纳米结构,其上伸出第二识别序列;核酸序列修饰酶与识别序列杂交,得到肌氨酸氧化酶和核酸纳米结构的复合体,第二核酸序列修饰酶与第二识别序列杂交,得到过氧化物酶和核酸纳米结构的第二复合体;将复合体和第二复合体组装到电化学装置的工作电极表面,进行电化学检测。根据本发明的电化学检测方法将结构核酸纳米技术、酶催化反应和电化学生物传感器相结合,实现了对肌氨酸小分子的定量检测。
主要参考资料
[1] CN201210578481.5 一种制备肌氨酸氧化酶的方法及应用
[2] CN201310301117.9 一种提高肌氨酸氧化酶稳定性的方法
[3] CN201611080806.1一种用于肌氨酸的电化学检测方法