背景及概述[1]
考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)一定范围内与蛋白质浓度成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,光吸收在465nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
制备[1-4]
考马斯亮兰应用举例如下:
1)运用考马斯亮兰G250显色剂测定壳聚糖中蛋白含量。方法:蛋白质分子均具有酰胺基团,考马斯亮兰G250染料上的阴离子与蛋白质上的酰胺结合,使溶液变为蓝色,于595nm处测定吸光度可计算出样品中蛋白质的含量。结果:考马斯亮兰G250分光光度法测定壳聚糖样品中蛋白质含量是可行的,相对标准偏差为3.6%~4.9%,回收率为93.2%~108.7%。结论:该法具有简便、快速、灵敏度高、重现性好等特点。
2)将牛奶用考马斯亮兰法测定,其吸光度为A前。同时,将其用1:2的乙醇变性沉淀,过滤后,滤液用相同的考马斯亮兰法测定,吸光度为A后。计算A后/A前作为判断牛奶是否掺假的根据。根据大量测量数据,正常比值应该在9%~12%,高于此数值,即为加入其它含氮物质,可判为掺假。
3)考马斯亮兰G250法(Bradford法)是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。将其用于检测果汁中的蛋白,研究发现,苹果汁中的几种主要成分,如:果糖、葡萄糖、蔗糖和苹果酸等不会对测定造成干扰,其吸收波长不变,标准曲线的线性较好。并对苹果浓缩汁生产中不同工序物料中的蛋白含量进行测定,测定结果的精密度较好,加标回收率在97.76%~103.20%之间。
4)考马斯亮兰G250法测定胃液蛋白质含量。采用改进的Bradford法对26例正常人、8例胃癌、24例溃疡及慢性胃炎、4例肠上皮化生以及4例萎缩性胃炎患者胃液进行蛋白质含量测定。结果:G250与胃液蛋白结合后的吸收波长为595nm,反应体系中加入20μl10mol/LNaOH后明显提高光吸收值(P<0.05),线性范围在0~500μg/ml间,比文献报道的高,胃液蛋白质与G250结合后30min内保持稳定,本法重复性好,回收率达93.7%。结果还提示:胃癌组的胃液蛋白质含量明显高于正常对照组和其它胃疾病组(P<0.01或P<0.05)。结论:用G250法测定胃液蛋白质含量是一种可靠、简便、快速、灵敏的方法,结果具有一定的临床意义。
主要参考资料
[1] 考马斯亮兰法测定壳聚糖中蛋白的含量
[2] CN201310582126.X一种用乙醇变性快速测定乳制品中蛋白质掺假的方法
[3] 考马斯亮兰G-250法测定苹果浓缩汁生产中的蛋白含量
[4] 考马斯亮兰G-250法测定胃液蛋白质含量及其临床意义