AGL1(PSOUP)感受态细胞

AGL1菌株为C58, RecA型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒 pTiBo542DT-DNA，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件， pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。1.0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。 2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1μg质粒DNA（体积不大于6ul，感受态转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。 3.启动电转仪，设置参数：C=25μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。 4.6000 rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天 （当平板只含有50μg/ml kan时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50μg/ml kan，20μg/ml rif时，需28℃培养60 h；如果使用的平板含有50μg/ml rif则需要28℃培养72-90 h）。可用于外源基因GFP在白三叶草生物反应器系统中转录的研究。AGL1菌株适用于水稻、拟南芥、杨树等植物的转基因操作，AGL1电转感受态特别适用于大质粒的转化。