酸性红 94

精确称取试样约1g，用水溶解并定容至100ml，取该液50ml，以此作为试样液，按OT-15中方法三测定。LD₅₀ 6.48g/kg(雄小鼠，经口)。重组人TNFα对pH和热均有一定的耐受性。在pH 6-10，4℃条件下，24h后仍有活性；60℃时，1h后仍有活性。大肠杆菌生产的TNFβ是非糖基化蛋白，在变性条件下容易凝聚，对胰蛋白酶、糜蛋白酶等酶类不敏感，对热不稳定，75℃失活，但其生化特性与天然TNFβ相似。主要用于抗肿瘤和抗病毒综合征的治疗。
不良反应：TNFα可能有发热、寒战、头痛、恶心、呕吐、食欲不振、全身倦怠、肌肉酸痛等；高剂量可导致休克、肾功能不全、白细胞及血小板减少和肝功能改变等。食用红色素。用于樱桃、鱼糕、海带鱼肉卷、香肠、糕饼、鱼松等，用量5～100mg/kg。用作吸附指示剂、细胞染色剂细菌染色剂；银量滴定法的吸附指示剂由四氯荧光素碘化后用氯化钠盐析而得(参照荧光桃红)。方法一、重组TNFα的工艺过程
细菌发酵 将工程菌接种于LB培养基，37℃震荡培养至A_600nm=1，转至M9培养基，于42℃诱导4h。离心，收集菌体。用pH为8的磷酸盐缓冲液(PB，10mmol/L)悬浮菌体，并用超声破碎菌体，离心收集上清液，对PB透析，得TNFα粗品。
工程菌[培养、发酵]→[37℃、42℃]发酵菌体[10mmol/L PB]→[pH8]TNFα粗品
DEAE-Sepharose FF 离子交换柱层析 离子交换柱用PB平衡，加TNFα粗品，用PB洗柱，再加75 mmol/L NaCl洗脱，收集各峰，测TNFα活性。
TNFα粗品[DEAE-Sepharose FF离子柱]→[75 mmol/L NaCl]TNFα活性组分I
Q-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH 8、20 mmol/LTris-HCl缓冲液平衡，然后加TNFα活性组分I，用80 mmol/L NaCl洗脱，收集各峰，测TNFα活性，得TNFα活性组分II。
TNFα活性组分I[Q-Sepharose FF离子柱]→[80 mmol/L NaCl]TNFα活性组分II
CM-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH为6的10mmol/L PB平衡，加TNFα活性组分II，再依次用该PB液、PB液加200mmol/L NaCl及PB液加600 mmol/L NaCl分步洗脱，收集各洗脱液，测TNFα活性，即得TNFα纯品(在4℃时，通过三次常压离子交换，电泳表明：PB液加600 mmol/L NaCl的洗脱峰为TNFα单一条带，可得TNFα纯品)。
TNFα活性组分II[CM-Sepharose FF离子柱]→[PB、200及600mmol/L NaCl]TNFα纯品
方法二、对合成的TNFα突变改造
突变改造 用多位点突变引物和PCR方法对合成的TNFα基因突变改造，使其第二位精氨酸密码子CGT变为赖氨酸密码子AAA，即得突变基因TNF-K2。
TNFα基因[多位点突变引物、PCR方法]→TNF-K2
转化、重组 将TNF-K2插入载体pSB-92的P_L启动子下游，转化E．coliJM103，经酶切鉴定筛选转化子，得重组质粒pSB-TNF-K2。TNF-K2[pSB-92]→pSB-TNF-K2
培养、诱导 将pSB-TNF-K2于30℃培养至对数生长期，于42℃诱导4h，即得突变体[Lys²]TNFα，其分子量为17kD，比活性为6.8×10⁷U/mg 蛋白，是一种可溶性蛋白质。
pSB-TNF-K2[30℃, 42℃, 4h]→[Lys²]TNFα.