半胱氨酸(cysteine, Cys)含量测定试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
半胱氨酸(cysteine, Cys)含量测定试剂盒测定意义:
蛋白质含有三种含硫氨基酸:甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中,Cys是唯一一种含有巯基的含硫氨基酸,从甲硫氨酸转化而来,并且可与胱氨酸互相转化。Cys参与蛋白质二硫键的形成,经常是蛋白质活性中心的组成部分,还可以为其它生理生化反应提供巯基。此外,Cys大量积聚在皮肤和粘膜表面,在角蛋白生成中维持重要的巯基酶的活性,并且补充巯基,以维持皮肤的正常代谢,调节表皮最下层的色素细胞生成的底层黑色素。具有美白、解毒、改善炎症和过敏性皮肤等作用。
测定原理:
Cys还原磷钨酸生成钨蓝,在600nm处有吸收峰;通过600nm吸光度,计算Cys含量。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、85%磷酸和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。用前1天,向试剂三中加5 mL蒸馏水充分溶解,再加85%磷酸1.25mL,混匀后盖紧(防止水分散失)沸水浴2h;冷却后加20 mL蒸馏水,4℃可保存2周。
标准品:粉剂×1瓶,临用前加10 mL蒸馏水,充分溶解。1μmol/mL标准液,4℃避光保存。用不完的试剂4℃可保存3天。
半胱氨酸(cysteine, Cys)含量测定试剂盒半胱氨酸提取:
1、 液体样品中半胱氨酸提取:取0.1mL液体样品,加试剂一0.9mL,充分混匀,8000g
4℃离心10min,取上清液,待测。
2、 组织中半胱氨酸提取:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心10 min,取上清液待测。
3、 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
半胱氨酸(cysteine, Cys)含量测定试剂盒测定操作:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到600 nm,蒸馏水调零。
2. 空白管:取1mL玻璃比色皿,加入100 μL蒸馏水,500μL试剂二,500μL试剂三,混匀后室温静置15 min,于600nm处测定吸光值,记为A空白管。
3. 标准管:取1mL玻璃比色皿,加入100 μL标准液,500μL试剂二,500μL试剂三,混匀后室温静置15 min,于600nm处测定吸光值,记为A标准管。
4. 测定管:取1mL玻璃比色皿,加入100 μL上清液,500μL试剂二,500μL试剂三,混匀后室温静置15 min,于600nm处测定吸光值,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需要做一次。
计算公式:
1. 按液体样品的体积计算:
半胱氨酸含量(μmol/mL)=[C标准品×V标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×(V样总÷V样)=1×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
2. 按样本质量计算:
半胱氨酸含量(μmol/g鲜重)=[C标准品×V标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×(V样总÷V样)÷W=1×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W
3. 按照蛋白浓度计算:
半胱氨酸含量(μmol /mg prot)= [C标准品×V标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]÷(V样×Cpr)=1×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr
4. 按细胞数量计算:
氨基酸含量(μmol /104 cell)=[C标准品×V标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)] ×(V样总÷V样×细胞数量)=1×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷细胞数量
C标准品:标准品浓度,1μmol/mL;V标准品:反应体系中加入标准品体积,0.1 mL;V样:反应体系中加入样品提取液体积,0.1 mL;V样总:加入提取液体积,1mL。W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
注意事项:
最低检出限为100μmol/L。
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