组织无机磷含量测定试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
组织无机磷含量测定试剂盒测定意义:
无机磷主要指磷酸根,参与生物体内多种代谢,包括能量代谢、核酸代谢、蛋白质磷酸化和脱磷酸化等等,此外促进碳水化合物的合成、转化和转运。
测定原理:
钼蓝与磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物质,通过测定660nm光吸收可计算无机磷含量。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前配制,加入20 mL蒸馏水,充分溶解后加入试剂二(全部),混匀。
标准品:液体×1支, 4℃保存。
无机磷提取:
按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到660 nm,蒸馏水调零。
2. 打开水浴锅,调节温度到40℃。
3. 空白管:取EP管,依次加入500μL蒸馏水,500μL试剂三,混匀后置于40℃水浴保温10min,室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度,记为A空白管。
4. 标准管:取EP管,依次加入50μL标准液,450μL蒸馏水,500μL试剂三,混匀后置于40℃水浴保温10min,室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度,记为A标准管。
5. 测定管:取EP管,依次加入50μL上清液,450μL蒸馏水,500μL试剂三,混匀后置于40℃水浴保温10min,室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需测定一次。
组织无机磷含量测定试剂盒组织无机磷含量计算公式:
(1) 按照蛋白含量计算
无机磷含量(μmol/mg prot)= [C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷Cpr
=1×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
无机磷含量(μmol/g )= [C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W
=1×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准液:1mmol/L;V总:上清液总体积,1mL=0.001 L;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样品质量,g。
注意事项:
1. 试剂三需临用前配制,并且当天使用完毕。
2. 40min内完成比色。
3. 最低检出限为10μmol/L。
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