组织总磷含量测定试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
组织总磷含量测定试剂盒测定意义:
磷的存在形态包括无机磷与有机磷。无机磷主要指磷酸根,参与生物体内多种代谢,包括能量代谢、核酸代谢、蛋白质磷酸化和脱磷酸化等。通过测定总磷与无机磷含量即可了解作物对磷的利用率,进而为合理施肥提供依据。
测定原理:
总磷经消化后,转化成无机磷。钼蓝法是测定无机磷含量的经典方法,一定条件下,钼蓝与磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物质,通过测定660nm光吸收,即可计算无机磷含 量,进而可计算出组织中总磷含量。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、离心机、水浴锅、可调式移液枪、1ml玻璃比色皿、蒸馏水和浓硫酸。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1瓶,4℃保存(强腐蚀性,强氧化性)。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前配制,加入15 mL蒸馏水,溶解后再加入10 mL试剂二,混匀。
标准品:液体×1支,-20℃保存。
有机磷消化:
取带盖试管,进入精确称取50℃烘干至恒重的约0.1 g组织,加浓硫酸1.0 mL,盖紧(防止水分散失)后沸水浴10min左右,待溶液呈黑色或棕色时取出。稍冷后,加试剂一200μL,充分混匀,盖紧后继续沸水浴,直到溶液呈透明状,取出室温冷却后,加蒸馏水8.8 mL,充分混匀;室温,8000g,离心10min,取上清液待测。
组织总磷含量测定试剂盒测定操作:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到660 nm,蒸馏水调零。
2. 打开水浴锅,调节温度到40℃。
3. 空白管:取EP管,依次加入500μL蒸馏水,500μL试剂三,混匀后置于40℃水浴保温10min,室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度,记为A空白管。
4. 标准管:取EP管,依次加入50μL标准液,450μL蒸馏水,500μL试剂三,混匀后置于40℃水浴保温10min,室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度,记为A标准管。
5. 测定管:取EP管,依次加入50μL上清液,450μL蒸馏水,500μL试剂三,混匀后置于40℃水浴保温10min,室温冷却10 min后于660 nm测定吸光度,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需测定一次。
组织总磷含量计算公式:
(1) 按照蛋白含量计算
总磷含量(mmol/mg prot) = [C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷Cpr
= 1×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷W
(2) 按照样本质量计算
总磷含量(mmol/g 干重)= [C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W
= 1×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准液:1 mmol/L;V总:上清液总体积,10 mL=0.01 L;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样品质量,g。
注意事项:
1. 试剂三需临用前配制,并且当天使用完毕。
2. 40min内完成比色。
3. 最低检出限为10μmol/L。
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