亚铁氧化酶(Hephaestin,HP)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
Hephaestin (HP)作为铜蓝蛋白的同系物,是近年来发现的铁转运蛋白亚铁氧化酶,HP属亚铁氧化酶家族成员,具有亚铁氧化酶的活性,参与体内铁代谢。HP的表达可受铁、铜及锌等金属离子的调节。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+,在介导铁的跨膜转运中有重要作用。
亚铁氧化酶(Hephaestin,HP)试剂盒测定原理:
HP催化Fe2+氧化为Fe3+,Fe2+和ferrozine反应显色,在560 nm下有特征吸光值。通过测定Fe2+的减少速率可测得亚铁氧化酶的活性。
自备用品:
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体50 mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:液体3 mL×1瓶,4℃保存;
试剂三:液体30 mL×1瓶,4℃避光保存。
粗酶液提取:
按照组织质量(g):水mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL蒸馏水),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
亚铁氧化酶(Hephaestin,HP)试剂盒测定步骤:
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至560 nm,蒸馏水调零。
2. 在玻璃比色皿中加入下列试剂
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 250 | 250 |
试剂二 | 50 | 50 |
样本 | 50 | 50 |
蒸馏水 | 150 | 150 |
试剂三 | 混匀,40℃静置30 min | 500 |
试剂三 | 500 |
|
混匀,立即测定A对照和A测定,ΔA=A对照-A测定。(每个测定管需设一个对照管) |
HP活性计算:
标准曲线:y = 16.427x - 0.0006,R2 = 0.9998;(x为标准品浓度,μmol/mL;y为吸光值ΔA)
(1)按样本质量计算
单位定义:每g样本每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位。
HP(nmol/min/g 鲜重)=(△A+0.0006)÷ 16.427×V总÷T ÷(W× V样÷V样总)× 1000
= 20.29×(△A+0.0006)÷W
(2)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg蛋白每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位。
HP(nmol/min/mg prot)=(△A+0.0006)÷ 16.427×V总÷T ÷(Cpr×V样)× 1000
= 20.29×(△A+0.0006)÷Cpr
V总:反应体系体积,0.1 mL;V样:加入样本体积0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30min;W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;
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