概述[1]
血竭为棕榈科植物麒麟竭果实及树干中的树脂。此外,龙舌兰科植物龙血树(Dracaenaombetkatschy)的树脂也作为血竭用。其主要成分有血竭素、血竭红素等。实验研究表明,血竭有抗炎止痛、抗真菌及抗血栓等药理作用。血竭素高氯酸盐(dracorhodinperchlorate)已人工合成,其药理及毒理研究报道较少。
应用[1-2]
血竭素高氯酸盐诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡。MTT法测定血竭素高氯酸盐对HeLa细胞的细胞毒作用。通过显微镜,荧光染色观察细胞形态学变化,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA片断化。用Western印迹法分析药物对蛋白质表达的影响。结果 血竭素高氯酸盐明显抑制HeLa等细胞的增殖,诱导HeLa细胞调亡。Caspase1,3,8,9及家族抑制剂可明显抑制血竭素高氯酸盐诱导的凋亡。Western印迹结果显示血竭素高氯酸盐作用12h后Bax及BclXL的表达明显改变,caspase3,8前体及caspase3底物ICAD和PARP发生降解。结论 血竭素高氯酸盐(60μmol·L-1)通过改变Bax/BclXL的表达激活caspase途径诱导HeLa细胞凋亡。
血竭素高氯酸盐促进瘢痕成纤维细胞凋亡的作用。应用四甲基偶氮唑(MTT)法、特异性荧光染色和原位末端标记技术(TUNEL)分别检测血竭素高氯酸盐对成纤维细胞的抑制率和凋亡指数。结果MTT法显示血竭素高氯酸盐对成纤维细胞的抑制率增高,且呈现浓度和时间依赖性(P<0.05)。特异性荧光染色和TUNEL法检测凋亡指数,均呈剂量依赖性增高(P<0.05)。结论血竭素高氯酸盐对瘢痕成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用,且呈量效关系促进成纤维细胞发生凋亡。
制备[3]
血竭素高氯酸盐制备如下:
步骤1):制备化合物Ⅰ(2,4,6-三甲氧基苯甲醛)
将化合物SM(间苯三酚三甲醚)100g和DMF500ml混合,冰盐浴降温至0℃以下,滴加201g(2.2eq)三氯氧磷,控温0℃以下,加毕,在0℃以下保温反应1h,TLC跟踪反应完成;将反应液倒入冰水中,用碳酸钾溶液调至弱碱性(pH为8-10),析晶过夜,抽滤得白色固体,干燥得101g产品(化合物Ⅰ),其氢核磁共振(HNMR)谱图见图1。
步骤2):制备化合物Ⅱ(1,3,5-三甲氧基甲苯)
将化合物Ⅰ的产品80g溶于乙二醇500ml,加入85%水合肼4eq.,80℃反应3h,基本溶解,TLC跟踪原料消失,然后,向反应液中加入氢氧化钾4eq,升温至120℃回流反应,反应3h,TLC跟踪反应完成,降温至10-25℃,倒入冰水中,抽滤,水洗,得75g产品(化合物Ⅱ)。
第3)步:制备化合物Ⅲ(3-甲基-2,4,6-三甲氧基苯甲醛)
将式化合物Ⅱ的产品50g溶于DMF中200ml,冰盐浴降温至0℃以下,滴加2.2eq.三氯氧磷,控温0℃以下,加毕,室温下反应,TLC跟踪反应完成;将反应产物倒入冰水中,碳酸钾溶液调至弱碱性(pH为8-10),析晶过夜,抽滤得白色固体,干燥,得45g产品(化合物Ⅲ),其氢核磁共振(HNMR)谱图见图2。
步骤4):制备化合物Ⅳ(3-甲基-2,4,6-三羟基苯甲醛)
将化合物Ⅲ的产品40g溶于二氯甲烷200ml,在氮气保护下,降温至-78℃以下,滴加三溴化硼6eq,控温-78℃以下,加毕,自然升温至室温反应过夜(约12-24小时),TLC跟踪反应完成;将反应产物倒入冰水中,乙酸乙酯萃取,饱和食盐水洗,浓缩得30g化合物Ⅳ的粗品,直接用于下一步反应。
第5)步:制备化合物Ⅴ(2-羟基-3-甲基-4,6-二苄氧基苯甲醛)
将化合物Ⅳ的产品20g溶于丙酮40ml,加入碳酸钾3.5eq.,冰水浴降温,滴加溴苄2.2eq,加毕,50-60℃左右反应过夜,TLC跟踪反应;将反应物倒入水中,乙酸乙酯萃取,饱和食盐水洗,浓缩得30g化合物Ⅴ的粗品。柱层析纯化,得产品15g,鉴定为一个在苯环羟基上引入苄基的中间体,其氢核磁共振(HNMR)谱图见图3。
步骤6):制备化合物Ⅵ(2-甲氧基-3-甲基-4,6-二苄氧基苯甲醛)
将化合物Ⅴ的产品15g溶于DMF50ml中,加入碳酸二甲酯200ml和DBU1.2eq.,加毕回流过夜(约12-24小时);次日TLC跟踪,反应完毕,降至室温,有固体析出,加入500ml水,搅拌30min,乙酸乙酯萃取分液,旋干,得10g化合物Ⅵ的产品,鉴定为一个在苯环羟基上引入甲基的中间体。
步骤7):制备化合物Ⅶ(2-甲氧基-3-甲基-4,6-二羟基苯甲醛)
将式化合物Ⅵ的产品8g加入到乙酸乙酯50ml中,加入甲醇100ml溶解,加入钯碳0.8g,氮气置换,氢气置换(氢气压力1-5atm),室温反应过夜(约12小时),TLC跟踪,原料消失;将反应产物抽滤,乙酸乙酯淋洗,旋干得产品。回锅反应(操作同前),TLC跟踪反应完成。抽滤,乙酸乙酯淋洗,旋干得4g。
步骤8):制备化合物Ⅹ(即血竭素)
将化合物Ⅷ的产品4g溶于甲醇中,向其中滴加饱和醋酸钠水溶液50mL,放置,析晶,得到血竭素。
步骤9)血竭素高氯酸盐的制备方法
将化合物Ⅷ的产品5g用60ml甲醇溶解,滴加高氯酸2ml的甲醇溶液80ml,搅拌反应2h。析出橙红色晶体,过滤,固体用甲醇重结晶,得血竭素高氯酸盐纯品5g,氢核磁谱图化学位移数据为:(MeOD,300M),2.396,Me,3H;4.094,MeO,3H;7.391,ArH,1H;7.731-7.858,ArH,3H;8.414-8.469,ArH,3H;9.311-9.340,1H。
主要参考资料
[1] 血竭素高氯酸盐诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的机制
[2] 血竭素高氯酸盐促进瘢痕成纤维细胞凋亡的作用
[3] CN201610059078.X血竭素及其盐、中间体的制备方法以及这些中间体化合物
[4] CN201610059078.X血竭素及其盐、中间体的制备方法以及这些中间体化合物