背景及概述[1]
醋酸地加瑞克(地加瑞克 acetate)是治疗前列腺癌的主要用药之一，目前主要通过固相合成得到地加瑞克，然后进行醋酸转盐形成醋酸地加瑞克。地加瑞克结构为Ac-D-2Nal-D-Phe(4-Cl)-D-Ala(3-Pyridy)-Ser-Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2.。地加瑞克的传统固相合成方法如下：通过固相合成载体进行逐个的氨基酸合成。然而，该方法中Aph(Hor)重复与碱接触，导致二氢尿嘧啶部分转化为乙内酰，导致副反应发生。专利公开的地加瑞克合成方法中，6位氨基酸残基D-4-Aph(Cbm)在合成中采用了侧链Cbm基团不保护的Fmoc-D-4-Aph(Cbm)-OH或者侧链Cbm用t-Bu保护的Fmoc-D-4-Aph(t-Bu-Cbm)-OH。然而，固相合成中采用侧链不保护的Fmoc-D-4-Aph(Cbm)-OH，如果反应温度控制不当，在最后的乙酰化封端过程中容易产生在侧链Cbm基因上的乙酰化副产物，该副产物难以分离纯化，将影响工艺的效率和产品的质量。采用侧链用叔丁基保护的Fmoc-D-4-Aph(t-Bu-Cbm)，在完成连结后需要去除保护基，而Aph(t-Bu-Cbm)侧链上叔丁基的脱除比较困难，需要在强酸水溶液中加热条件下才能完全脱除，加大了产生消旋等杂质的可能性，影响产品质量。另外还有一些固相片段合成方法用以合成地加瑞克，然而，固相片段缩合投入的每个片段都是2倍过量，严重浪费肽片段，造成合成成本过高。同时，因固相片段缩合的树脂取代值限制，物料通量降低，浪费溶剂，产生大量废液。
应用[1]
醋酸地加瑞克是丹麦辉凌制药有限公司研发的促性腺激素释放激素(GnRH)受体抑制剂类药物，可逆性抑制垂体GnRH受体来减少促性腺激素释放继而抑制睾酮的释放。本品通过抑制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮来延缓前列腺癌的生长和恶化。以激素治疗前列腺癌来降低睾酮浓度的初期却造成睾酮浓度激增，此初始刺激该激素受体可暂时性促进肿瘤生长而不是抑制它，而地加瑞克则不会。美国FDA于2008年12月批准地加瑞克上市，主要针对晚期前列腺癌患者，通过抑制睾丸激素来延缓前列腺癌的病程发展。
药动学及新剂型的研究[2]
在一项对地加瑞克药动学的研究中， 以雄性小猎犬为研究对象， 评估了皮下注射与肌内注射两种给药方法地加瑞克的药动学参数， 并且研究了不同的给药剂量(0.25 ～ 1.5 mg·kg-1)与浓度(1.25 ～ 40mg·mL-1 )对药物吸收的影响。结果表明， 皮下注射与肌内注射给药后， 药物血浆浓度与时间的关系符合二室模型， 分为两阶段， 最开始是一个快的一级动力学过程， 血浆中药物浓度水平快速增加， 而后则是一个慢的一级动力学过程， 慢的吸收过程半衰期为268 h(约11 d)， 肌内注射与皮下注射相比， 肌内注射达峰时间更快， 两种给药方法达峰时间分别为2.0 h和3.7 h， 平均最高峰值分别为64 和31 ng·mL-1 。实验还发现， 当药物浓度从1.25 ng·mL-1增加到40 mg· mL-1时， 药物的吸收量减少大约50%， 吸收速率也降低。有学者推测在给予地加瑞克后， 药物与注射部位组织蛋白相互作用， 在注射部位形成胶体结构样的蓄积池， 这种结构可以延长药物作用时间， 使药物血药浓度长期维持在有效水平。已有实验证明， 与其他GnRH拮抗剂(如abarelix， ganirelix， cetrorelix)相比， 地加瑞克具有更长作用时间及低的组胺反应。为了获得更长的作用时间， 研究者也在尝试开发新的剂型， 如亮丙瑞林(leuprorelin)的载体微粒已经上市。而最近对地加瑞克新剂型的开发研究又有了进展， 即将地加瑞克掺合进入poly(DL-lactide-co-glycolide)(PLGA)载体， 经过喷雾干燥形成新的地加瑞克-PLGA微粒， 动物实验表明这种地加瑞克-PLGA微粒与地加瑞克比较， 在相同剂量下， 能够延长1周的作用时间。前列腺癌的药物去势治疗， 要求药物具有长的作用时间， 这样可以使Ts长期抑制在适当水平。早期的GnRH拮抗剂(如Nal-Glu)由于作用时间短需要每天皮下注射， 这样在注射部位引起组胺反应， 并且由于药物水溶性的限制， 导致注射部位的硬结形成， 限制了它的使用。而新一代的GnRH拮抗剂从分子结构上及剂型上都进行了较大的改进，使作用时间显著延长， 不需每天给药， 并且组胺反应也减少甚至消失。
制备[3]
合成醋酸地加瑞克，具体工艺如下：
1）六肽树脂片段III的合成：反应柱中依次加入取代度为0.68mmol/g的Reink amide MBHA树脂100g，使用DMF溶胀30min后抽滤除去溶剂，然后在反应柱中加入20wt％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，反应30min后滤除溶液，树脂使用DMF洗涤六遍。四口瓶中加入42.3g Fmoc-D-Ala-OH(136mmol)，19.3g Oxymapure(136mmol)，控温0～5℃加入17.2g DIC(136mmol)活化氨基酸5～10min。活化后的溶液转移至多肽反应釜中用氮气鼓泡反应，控温20～25℃反应2h后使用茚三酮显色法进行反应跟踪，树脂无色透明则反应完全，树脂颗粒显色则未反应完全，需要延长反应直至树脂无色透明。重复上述脱保护步骤及缩合步骤按照肽链顺序分别缩合连接Fmoc-Pro-OH，Fmoc-iLys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D-Aph(Cbm)-OH，Fmoc-Aph(Hor)-OH，得到六肽树脂片段III。
2）四肽片段II的合成：反应柱中依次加入取代度为1.15mmol/g的CTC树脂85g，使用DMF溶胀30min后抽滤除去溶剂，四口瓶加入112.4g Fmoc-Ser(tBu)-OH(293.2mmol)，DMF 850ml溶解氨基酸，加入DIPEA 75.8g(586.4mmol)搅拌10min后体系转移至多肽反应柱中用氮气鼓泡反应2h后滤除反应液。DMF洗涤树脂6次，然后反应柱依次加入DMF，甲醇(85ml)，DIPEA 75.8g(586.4mmol)。控温20～25℃反应2h以对剩余的活性位点进行封端，反完毕后DMF洗涤树脂6遍，甲醇二氯甲烷交替洗涤收缩树脂。得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC resin树脂120g，取代度0.80mmol/g。称取120g取代度为0.80mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-CTC resin树脂(96mmol)加入固相反应器中，用DMF溶胀30min后抽滤除去DMF，然后反应柱中加入20wt％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，反应30min后滤除溶液，树脂使用DMF洗涤六遍。称取Fmoc-3-(3-pyridy)-D-Ala-OH(74.6g，192.1mmol)，Oxymapure(27.3g，192.1mmol)加入DMF溶解，控温0～5℃加入DIC(24.2g，191.6mmol)，加毕搅拌5～10min后转移至反应釜进行反应。反应2h后使用茚三酮显色法进行反应跟踪，直至树脂无色透明则反应完全。重复上述脱保护步骤及缩合步骤按照肽链顺序分别缩合连接Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH和Fmoc-D-2Nal-OH。连接完肽链后，继续加入20wt％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，反应30min后滤除溶液，树脂使用DMF洗涤六遍。其次，加入乙酸酐/DIPEA＝3：6(eq)反应1h进行封端反应。反应完，用甲醇/二氯甲烷收缩树脂并干燥，得到四肽树脂片段I。使用0.5wt％TFA/DCM溶液对四肽树脂片段I进行切割反应2h，滤液浓缩后使用甲基叔丁基醚逼晶，过滤，得到四肽片段II，共计66.6g，收率95％。
3）全肽树脂的合成：向反应柱的六肽树脂片段III中加入20wt％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，反应30min后滤除溶液，树脂使用DMF洗涤六遍。称取四肽片段II(59.6g，1.2eq)，加入DMF溶解，控温20～25℃加入MYMsA(10.85g，1.2eq)活化四肽片段II形成活性中间体，加毕搅拌2～3h后转移至反应柱进行反应。反应2h后使用茚三酮显色法进行反应跟踪，树脂有颜色则继续反应。无色透明则反应完全。反应完毕后抽去溶剂，树脂使用DMF洗涤6遍。树脂使用甲醇与二氯甲烷交替洗涤收缩，收缩完毕氮气吹扫烘料至恒重后收料，得到全肽树脂。
4）地加瑞克粗产物的制备：连接完毕的全肽树脂使用95vol％TFA/5vol％H2O比例切割液反应3～5h，滤液浓缩后使用甲基叔丁基醚逼晶，过滤，得到终产品104.3g，粗肽收率94％，纯度95％。
5）纯化、转盐：采用反向液相色谱法纯化：用AQ的填料，A相：0.05wt％TFA的水溶液；B相：0.05wt％TFA的乙腈溶液制备纯化，转盐使用1wt％AcOH的水溶液与乙腈作为流动相梯度洗脱后冻干，得到最终产品醋酸地加瑞克。HPLC测纯度，纯度为99.94％，单杂含量为0.06％，＜0.1％。醋酸地加瑞克的总收率为80.8％。
主要参考资料
[1] CN201910748640.3 醋酸地加瑞克的合成方法
[2] 治疗前列腺癌的新型GnRH拮抗剂地加瑞克
[3] CN201910614837.8 一种合成醋酸地加瑞克的方法