背景[1-3]
PK-15猪肾细胞建系于1955（Stice,E）。是PK-1a细胞的克隆系。该细胞系可用于多种病毒的增值及特性研究。另外，电镜观察发现，PK-15细胞内有C-型病毒颗粒存在，是研究C-型病毒的材料。
细胞复苏操作要点：
1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。
2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。
4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。
5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。
6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
应用[4][5]
用于猪CAⅢ基因CDS克隆、表达及其对PK15细胞增殖的影响研究
通过RT-PCR和克隆测序获得猪CAⅢ基因的CDS序列;通过生物信息学技术预测该基因编码的蛋白质的结构、功能、定位等;利用qRT-PCR技术检测CAⅢ基因的时空表达特征;利用同源重组方法和CRISPR/Cas9技术构建pcDNA 3.1-EGFP-CAⅢ过表达载体及敲除载体,并转染至PK15细胞中,qRT-PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因ki67、Casparse3和Parp2 mRNA表达量,CCK-8检测细胞增殖率;通过在PK15细胞中添加甲基化抑制剂试验检测CAⅢ基因是否受DNA甲基化调控,以探讨CAⅢ基因对细胞增殖的影响及作用机制。
试验结果表明,CAⅢ编码260个氨基酸。由α-螺旋及β-转角等折叠形成一个无信号肽在细胞质发挥作用的亲水性碱性蛋白。CAⅢ基因在各个组织中均有表达。大白猪和马身猪在0、1、2月龄低表达且差异不显著,在3月龄逐渐增加且差异极显著,4月龄开始下降,5月龄（马身猪）开始升高且表达量最高。
功能验证结果表明,pcDNA3.1-EGFP-CAⅢ载体转入PK15细胞中,细胞增殖基因ki67 mRNA表达量增加,凋亡基因Caspare3和Parp2 mRNA减少,且细胞增殖率增加,pHS-CR054-CAⅢ试验结果反之。
甲基化试验结果表明,添加20μmol/L甲基化抑制剂,CAⅢmRNA表达量增加,但是PK15细胞增殖率降低。研究成功克隆了猪CAⅢCDS区并分析该基因的生物信息学及时空表达特性。成功构建过表达和敲除载体探讨CAⅢ基因对细胞增殖作用,并验证CAⅢ基因受甲基化的调控,该基因可能受DNA甲基化的调控从而对细胞增殖产生影响。
参考文献
[1]Crystallography and Its Impact on Carbonic Anhydrase Research[J].Carrie L.Lomelino,Jacob T.Andring,Robert McKenna,Qi-Dong You.International Journal of Medicinal Chemistry.2018
[2]Protective Role of Carbonic Anhydrases III and VII in Cellular Defense Mechanisms upon Redox Unbalance[J].Anna Di Fiore,Daria M.Monti,Andrea Scaloni,Giuseppina De Simone,Simona M.Monti,Reiko Matsui.Oxidative Medicine and Cellular Longevity.2018
[3]Carbonic anhydrase III protects osteocytes from oxidative stress[J].Chao Shi,Yuhei Uda,Christopher Dedic,Ehab Azab,Ningyuan Sun,Amira I.Hussein,Christopher A.Petty,Keertik Fulzele,Maria C.Mitterberger-Vogt,Werner Zwerschke,Renata Pereira,Kunzheng Wang,Paola Divieti Pajevic.The FASEB Journal.2018(1)
[4]Insights into the role of reactive sulfhydryl groups of Carbonic Anhydrase III and VII during oxidative damage[J].Daria M.Monti,Giuseppina De Simone,Emma Langella,Claudiu T.Supuran,Anna Di Fiore,Simona M.Monti.Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemis.2017(1)
[5]乐宝玉.猪CAⅢ基因CDS克隆、表达及其对PK15细胞增殖的影响[D].山西农业大学,2019.