背景[1-3]
丝状真菌蛋白提取试剂盒适用于从各种丝状真菌中提取总蛋白。优化的裂解液配方可以充分释放各种有隔膜菌丝和无隔膜菌丝蛋白以及各种菌丝变态体蛋白，提取过程简单方便，可在1小时内完成。
丝状真菌蛋白电泳胶图
丝状真菌蛋白提取试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。提取的蛋白用于二维电泳、报告基因检测、SDS-PAGE电泳检测、Western blotting、凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活分析等下游实验。
使用方法：
1．提取液准备：
每500μl提取液A中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。
2．取100-300mg真菌组织样本，用PBS洗一次。离心收集菌体沉淀。
3．在菌体沉淀中加入500μl提取液A，用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
4．将匀浆液在500g离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
5．在上清中加入100μl提取液B，充分混匀。
6．将提取液在2-8℃振荡30-40分钟。
7．将提取液在4℃下12000-16000×g条件下离心10分钟，弃沉淀。
8．将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。
9．将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
应用[4][5]
用于丝状真菌纤维素酶高产菌株遗传改造及p24蛋白家族研究研究
针对位于丝状真菌分泌路径上p24蛋白进行生理功能研究。
1草酸青霉JUA10-1胞外木质纤维素降解酶系的理性改造通过同源比对确定草酸青霉中纤维素酶转录抑制因子有creA和acel。利用凝胶阻滞迁移实验证明草酸青霉CreA结合结构域能和cel7a启动子-216----446区发生结合,Acel结合结构域和cel7a启动子-446----643区发生结合。
采用转录抑制因子creA和acel的结合结构域加上转录激活因子xlnR的效应结构域组成人工激活元件,导入到草酸青霉JUA10-1中,构建成功草酸青霉纤维素酶高产菌株CXA。
在流加葡萄糖的合成培养基中,FPase、pNPCase、pNPGase和胞外蛋白分泌量分别是出发株的1.14,1.12,1.64和1.39倍,同时主要纤维素酶,半纤维素酶基因在转录水平都有明显提高。
在流加生物质水解液的工业化廉价培养基培养时,草酸青霉pNPCase,pNPGase和CMCase是出发菌株的1.32,1.56和1.10倍,同时在转录水平上验证主要纤维素酶基因表达量也提高。这说明构建的纤维素酶高产菌株草酸青霉CXA具有很好的工业应用前景。
2草酸青霉和里氏木霉p24同源蛋白Erp生理功能比较p24蛋白家族是位于真核细胞内膜系统上小分子的跨膜蛋白。在酵母和果蝇中,其主要作用为参与物质选择性运输及质量控制。
在丝状真菌中对p24y家族同源蛋白Erp进行生理功能研究并发现了一种新的纤维素酶转录激活机制。通过序列比对发现草酸青霉pErp和里氏木霉tErp蛋白氨基酸序列相似性达75%以上,但是Erp在两株菌株中参与的生理路径明显不同。
形态发生方面：里氏木霉tErp参与分生孢子生成,细胞膜完整性维持及菌丝极性形成；草酸青霉pErp参与维持细胞膜完整性及菌丝侧枝成熟。蛋白分泌方面,敲除erp基因后两株菌内部都会造成分泌压力,但两种菌株转录水平响应机制明显不同：里氏木霉下调相应基因表达；草酸青霉上调相应基因表达。
参考文献
[1]Vesicle trafficking,organelle functions,and unconventional secretion in fungal physiology and pathogenicity[J].Jun-ya Shoji,Takashi Kikuma,Katsuhiko Kitamoto.Current Opinion in Microbiology.2014
[2]Plant Cell Wall–Degrading Enzymes and Their Secretion in Plant-Pathogenic Fungi[J].Christian P.Kubicek,Trevor L.Starr,N.Louise Glass.Annual Review of Phytopathology.2014
[3]A comparative systems analysis of polysaccharide‐elicited responses in N eurospora crassa reveals carbon source‐specific cellular adaptations[J].J.Philipp Benz,Bryant H.Chau,Diana Zheng,Stefan Bauer,N.Louise Glass,Chris R.Somerville.Molecular Microbiology.2014(2)
[4]Penicillium decumbens BrlA extensively regulates secondary metabolism and functionally associates with the expression of cellulase genes[J].Yuqi Qin,Longfei Bao,Meirong Gao,Mei Chen,Yunfeng Lei,Guodong Liu,Yinbo Qu.Applied Microbiology and Biotechnology.2013(24)
[5]王方忠.丝状真菌纤维素酶高产菌株遗传改造及p24蛋白家族研究[D].山东大学,2014.