背景[1-3]
细菌蛋白提取试剂盒能够从细菌细胞中提取具有生物活性的可溶性蛋白质和高纯度包涵体。能够与FLAG，poly-His和GST融合蛋白亲和层析纯化系统兼容，还能与许多酶，蛋白质和蛋白酶抑制剂混合物兼容。
细菌蛋白提取试剂盒采用温和的离子型去污剂裂解提取，无需超声或反复冻融；加入兼容的蛋白酶抑制剂尽量保证蛋白质的完整性；提取的蛋白质可以用于后续FLAG、poly-His和GST标签蛋白的亲和纯化，也可以兼容许多蛋白的生化测定实验。
细菌蛋白提取胶图
该试剂盒能够满足1升细胞培养物（OD 600=1）或10X 100~200 mg湿重的大肠杆菌的提取实验。
提取步骤：
1.先取0.5 mL的10X Cell lysis buffer用去离子水稀释成5 mL的1X Cell lysis buffer。
2.5000 xg离心10 min来收集表达目的蛋白的宿主菌，弃掉上清并用1X PBS缓冲液冲洗沉淀，将细菌沉淀每100 mL菌体
培养物（OD600=1时）重悬于4 mL的1X Cell lysis buffer中。
3.向1X Cell lysis buffer中加入40μl PMSF和80μl Lysozyme，37°C孵育细菌悬浮液30 min。
4.将混合物放在摇床上孵育10 min。
5.加入20μl DNase/RNase，37°C下继续在摇床上孵育10 min。
6.4°C下3,000 xg离心30 min，去除沉淀不溶物，将细胞裂解液收集到干净的试管中。
7.各取10μl 2X SDS gel-loading buffer与10μl细胞裂解液混合煮沸，通过10%SDS-PAGE电泳实验，上样量20μl来分析
提取物。将含有目的蛋白的组分保存在-70°C或直接通过纯化柱纯化。
应用[4][5]
用于枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白的分离提取与应用
生理生化以及16SrRNA基因序列测定和聚类分析软件的分析鉴定菌株R21-4为枯草芽孢杆菌。抗菌谱的测定证实了R21-4抗菌蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和霉菌均有一定的拮抗作用,特别是对食品中的常见腐败菌,如蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、产气荚膜杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌等均有明显抗菌效果。
对枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白进行了分离提取,结果表明采用60%饱和度的硫酸铵可以沉淀82.5%的抗菌蛋白。经Sephadex G-75洗脱后,抗菌蛋白被分成两种组分,其中组分1仅对蜡样芽孢杆菌有拮抗性,而组分2中的抗菌蛋白对蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌均表现较好的抑菌效果,Tricine-SDS凝胶电泳检测结果表明,组分2中蛋白质的分子量在6.4-7.2kDa之间。
琼脂块再生法和液体培养法证实了枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白对细菌的作用方式是杀菌;镜下观察表明,抗菌蛋白使棉花黄萎病菌的孢子萌发受到抑制,菌丝扭曲畸变,进而原生质凝聚,最后导致菌丝断裂。
枯草芽孢杆菌R21-4经过自然选育及紫外诱变后筛选得到一株具有良好遗传稳定性的枯草芽孢杆菌R21-15。与对照相比,它抑制大肠杆菌的活性提高了58.49%。枯草芽孢杆菌R21-15抗菌蛋白具有较好的热稳定性,对胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶部分敏感。
参考文献
[1]Three biotechnical processes using Ashbya gossypii,Candida famata,or Bacillus subtilis compete with chemical riboflavin production[J].K.-P.Stahmann,J.L.Revuelta,H.Seulberger.Applied Microbiology and Biotechnology.2000(5)
[2]Identification and partial characterization of tochicin,a bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis subsp tochigiensis[J].H D Paik,S S Bae,S H Park,J G Pan.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.1997(4)
[3]Rhizocticin A,an antifungal phosphono-oligopeptide of Bacillus subtilis ATCC 6633:biological properties[J].Martin Kugler,Wolfgang Loeffler,Claudius Rapp,Armin Kern,Günther Jung.Archives of Microbiology.1990(3)
[4]Direct detection of an antimicrobial peptide of Pediococcus acidilactici in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J].Arun K.Bhunia,M.C.Johnson,Bibek Ray.Journal of Industrial Microbiology.1987(5)
[5]贾洁.枯草芽孢杆菌R21-4抗菌蛋白的分离提取与应用[D].中国农业大学,2005.