背景[1-3]
沉淀法MIRNA分离试剂盒可以从总RNA中直接分离纯化小RNA，不需要使用离心吸附柱。得到的小RNA长度大部分在200 nt以下，包括5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA和snRNA等。分离的MIRNA可用于RT-PCR、miRNA标记、microarray等后续实验。
沉淀法MIRNA分离试剂盒
使用方法：
1.在纯化好的100μl总RNA(含大RNA和小RNA)中，加入50μl溶液A，振荡30秒混匀。如果RNA样品体积不足100μl，可以用RNase-free水补足，如果体积超过100μl，可以用本公司核酸浓缩剂浓缩到100μl。
2.室温12000～15000g离心30分钟。小RNA在上清中，大RNA在沉淀中。
3.小心将上清液转移到干净的1.5mL RNase-free塑料离心管中。留下的沉淀可以用75%乙醇洗涤后做大RNA电泳对照用。
4.在上清液中加入200μl溶液B，振荡30秒混匀。
5.室温12000～15000g离心10分钟，小心弃上清。由于溶液B中有惰性的助沉剂，所以得到的小RNA沉淀肉眼可见。
6.加入1mL溶液C，震荡数秒。
7.室温12000～15000g离心10分钟，小心弃上清。
8.短暂离心数秒，小心吸弃残留液体(约50μL左右)。
9.在沉淀中(含小RNA)加入30-100μl RNase-free水，吹打溶解即得小RNA溶液。
10.先PAGE-银染检测小RNA纯度再使用。
应用[4][5]
用于血浆外泌体miR-92a-3p在系统性红斑狼疮中的作用及其机制研究
围绕血浆外泌体及其内部异常miRNA对SLE的影响及其潜在机制进行探究。
发现来源于SLE患者血浆的外泌体,一方面能够促进PBMC细胞凋亡并上调炎症细胞因子表达;另一方面还能够被肾小管上皮细胞HK2摄取,促进HK2细胞凋亡。通过高通量测序和RT-PCR验证,我们发现miR-92a-3p在SLE患者血浆外泌体中显著下调,且与疾病活动程度和狼疮性肾炎有关。
此外,miR-92a-3p水平还与患者24小时尿蛋白、补体C3和C4水平显著相关,但与患者性别、年龄、病程、是否服用免疫抑制剂和自身抗体水平无关。提示miR-92a-3p有望成为SLE诊断、判断疾病活动以及狼疮性肾炎评估的潜在标志物。
为了进一步探究血浆外泌体miR-92a-3p影响SLE的机制,我们利用miRNA数据库对miR-92a-3p的靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统和Western Blot方法进行验证。
结果表明,miR-92a-3p能够通过与LATS2基因3’UTR不完全互补抑制LATS2基因表达,并抑制下游YAP/TAZ磷酸化。肾组织免疫组织化学染色结果显示,LATS2在肾小管上皮细胞中高表达,在肾小球中低表达或不表达,且SLE患者肾小管和肾小球中LATS2水平略高于正常肾组织。
此外,miR-92a-3p还可促进PBMC和HK2细胞凋亡和炎症细胞因子表达。综上所述,发现SLE患者血浆外泌体能够通过调节PBMC和肾组织细胞凋亡及炎症反应影响疾病活动。而这一作用的实现可能与外泌体中miR-92a-3p及其靶基因LATS2有关。
参考文献
[1]LATS2 promotes apoptosis in non-small cell lung cancer A549 cells via triggering Mff-dependent mitochondrial fission and activating the JNK signaling pathway[J].Yudong Xie,Yanping Lv,Yanli Zhang,Zhenzhen Liang,Lili Han,Yiyang Xie.Biomedicine&Pharmacotherapy.2019
[2]Long non-coding RNA HOTTIP is upregulated in renal cell carcinoma and regulates cell growth and apoptosis by epigenetically silencing of LATS2[J].Feifei Peng,Xiaoli Shi,Yin Meng,Bo Dong,Guangchi Xu,Tingting Hou,Yang Shi,Tao Liu.Biomedicine&Pharmacotherapy.2018
[3]The Hippo Pathway Kinases LATS1/2 Suppress Cancer Immunity[J].Toshiro Moroishi,Tomoko Hayashi,Wei-Wei Pan,Yu Fujita,Matthew V.Holt,Jun Qin,Dennis A.Carson,Kun-Liang Guan.Cell.2016(6)
[4]Recent advances of exosomes in immune modulation and autoimmune diseases[J].Lina Tan,Haijing Wu,Ying Liu,Ming Zhao,Duo Li,Qianjin Lu.Autoimmunity.2016(6)
[5]王丽.血浆外泌体miR-92a-3p在系统性红斑狼疮中的作用及其机制研究[D].南方医科大学,2019.