背景[1-3]
小鼠睾丸间质细胞是取自小鼠睾丸间质的上皮细胞样贴壁细胞，小鼠睾丸间质细胞在LH作用下cAMP产量升高，但对促卵泡激素没有响应。小鼠睾丸间质细胞对LH的响应持续时间与血清批次有关；在LH存在下，小鼠睾丸间质细胞可以代谢胆固醇。生长培养基：DMEM/F12＋5%HS＋2.5%FBS＋1%P/S，培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%，温度：37℃。
小鼠睾丸间质细胞
细胞处理步骤：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10S的培养基来终止消化。
3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
应用[4][5]
用于ROS在硫酸镍诱导大鼠睾丸间质细胞内质网应激和线粒体凋亡通路中的作用研究
过体外培养大鼠睾丸间质细胞,观察硫酸镍致大鼠睾丸间质细胞ROS水平与细胞凋亡的关系,以及内质网应激和线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平的变化,探讨ROS在镍诱导大鼠睾丸间质细胞内质网应激和线粒体凋亡通路中的作用。
方法:（1）采用0.25%胶原酶消化大鼠睾丸组织分离出睾丸间质细胞,Percoll连续梯度分离液对其进行纯化,并采用贴壁培养法再次纯化。通过3β-HSD对纯化后的细胞进行纯度鉴定。
（2）纯化后的大鼠睾丸间质细胞,给予不同浓度（0、250、500和1000μmol/L）NiSO4分别处理0、6、12和24h,通过MTT法和LDH渗漏法检测各组细胞存活率和培养液中LDH活力。
（3）取对数生长期间质细胞,经自由基清除剂NAC和TEMPO提前干预1h后,再行500μmol/L NiSO4处理12h。采用DCFH-DA探针法观察大鼠睾丸间质细胞内ROS水平,DAPI荧光染色法观察细胞核形态学变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。
采用Western blot法检测大鼠睾丸间质细胞内质网应激相关蛋白GRP78、GADD153和Caspase-12,以及线粒体凋亡通路相关蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的表达水平。
结果:（1）纯化的间质细胞贴壁生长24h后,通过3β-HSD染色法鉴定,可得到纯度较高的间质细胞。
（2）与对照组比较,250、500和1000μmol/L NiSO4分别处理6、12和24h后,不同处理组细胞存活率均显著下降（P<0.05）,细胞培养液中的LDH活力均显著升高（P<0.05）,且随着NiSO4处理浓度和时间的增加,细胞存活率逐渐降低,细胞培养液中LDH活力也逐渐升高。
（3）与对照组比较,500μmol/L NiSO4处理12h组（NiSO4组）荧光显微镜下可见间质细胞中ROS水平明显升高。与NiSO4组比较,经5mmol/L NAC（NAC组）和1mmol/L TEMPO（TEMPO组）干预后,间质细胞中ROS水平明显下降（P<0.05）。
参考文献
[1]Mitochondrial ROS govern the LPS-induced pro-inflammatory response in microglia cells by regulating MAPK and NF-κB pathways[J].Junghyung Park,Ju-Sik Min,Bokyung Kim,Un-Bin Chae,Jong Won Yun,Myung-Sook Choi,Il-Keun Kong,Kyu-Tae Chang,Dong-Seok Lee.Neuroscience Letters.2014
[2]Moringa oleifera Supplemented Diets Prevented Nickel-Induced Nephrotoxicity in Wistar Rats[J].O.S.Adeyemi,T.C.Elebiyo,Joel B.Mason.Journal of Nutrition and Metabolism.2014
[3]Nitroxide TEMPO:A genotoxic and oxidative stress inducer in cultured cells[J].Xiaoqing Guo,Roberta A.Mittelstaedt,Lei Guo,Joseph G.Shaddock,Robert H.Heflich,Anita H.Bigger,Martha M.Moore,Nan Mei.Toxicology in Vitro.2013(5)
[4]Nickel species:Analysis and toxic effects[J].Journal of Trace Elements in Medicine and Biology.2012(1)
[5]孙铱钒.ROS在硫酸镍诱导大鼠睾丸间质细胞内质网应激和线粒体凋亡通路中的作用[D].兰州大学,2016.