背景[1-3]
U251细胞(人胶质瘤细胞)源自一位75岁患者的胶质母细胞瘤组织的成纤维细胞样贴壁细胞，生长培养基：DMEM＋10%FBS＋1%P/S气相：空气，95%；CO2，5%温度：37℃。
U251细胞(人胶质瘤细胞)
培养步骤：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于甘草酸对人胶质瘤U251细胞的作用及其机制的研究
研究甘草酸处理U251细胞后NF-κB活性亚基p65蛋白在细胞核中的改变。目的：观察甘草酸（Glycyrrhizic acid,GA）对人神经胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响,并通过检测NF-κB活性亚基p65在细胞核内表达的变化,探讨甘草酸抑制胶质瘤增殖的可能机制,为进一步研究甘草酸治疗胶质瘤提供理论基础和实验依据。
方法：1、细胞培养：人胶质瘤母细胞系U251复苏后在含10%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）的DMEM培养基中于37。C、5%C02培养箱中培养,隔天换液,3-4天传代一次,用于实验的细胞均处于对数生长期。
2、CCK-8法检测细胞生存率：取对数生长期的细胞,胰酶消化后混悬,细胞计数板计数后,接种于96孔板,每孔100μl,含3×103个细胞。待细胞贴壁后,将细胞培养液更换为空白对照液和不同浓度的甘草酸溶液,各实验组甘草酸浓度为1、2、4mmol/L,每组3个复孔,置于37。C、5%CO2培养箱中培养,分别于培养24、48、72h更换为DMEM培养基,同时每孔加入10u l CCK-8溶液,恒温培养箱内孵育2h,用全自动酶标仪在波长450nm处读取各孔光密度（OD）值。实验重复三次,并计算其平均值,细胞生存率计算公式如下：细胞生存率=（实验组OD值—本底组OD值）／（对照组OD值—本底组OD值）×100%,绘制生长抑制曲线图,并作统计学分析。
3、平板克隆实验：克隆形成是测定细胞增殖能力的常用方法,单个细胞在体外传代6次以上形成的细胞群成为克隆,一个克隆的大小约0.3-1.Omm,本实验采用平皿法,用含EDTA的胰酶将处于对数生长期的细胞消化为单细胞悬液,并以每孔300个细胞的密度接种于25cm2的塑料培养皿中。细胞在含有不同浓度甘草酸（0、1、2、4mmol/L）的细胞培养液中孵育10天后,弃去培养基,用PBS洗2次后,甲醇固定30分钟,冲洗后予龙胆紫染色,100倍显微镜下计数培养皿中所有紫色斑点。
4、细胞凋亡检测：根据细胞生存率结果,选取48小时作为检测细胞凋亡的特定时间点。
4.1、倒置相差显微镜下观察细胞形态,Hoechst33258染色U251细胞,荧光显微镜下观察细胞核形态：PBS冲洗细胞3次,对照组及甘草酸处理组细胞予Hoechst33258室温黑暗环境下染色l0min。再次予PBS冲洗细胞3次后,340nm波长的荧光显微镜下拍照并观察细胞核形态学变化。
4.2、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率：离心细胞,预冷的PBS冲洗,用100μl的结合缓冲液重悬细胞,各组加入2μlAnnexin V-FITC及2μ1的碘化丙啶的混合液,4。C黑暗环境下孵育15min后立即在流式细胞仪中行计数分析,记录每组早期凋亡及晚期凋亡细胞所占百分数。
5、免疫荧光检测：U251细胞接种至96孔板,2mmol/L的甘草酸处理48小时,4%多聚甲醛固定细胞,随即以10%的山羊血清封闭1小时。P65抗体4。C过夜孵育,次日PBS冲洗3次,每次20分钟,以含有Alexa Fluor488荧光的山羊抗兔抗体（1：500）孵育,同时用DAPI着色细胞核,并在荧光显微镜下拍照。
参考文献
[1]Over-expression of ARHI decreases tumor growth,migration,and invasion in human glioma[J].Jing Chen,Songsheng Shi,Weizhong Yang,Chunmei Chen.Medical Oncology.2014(3)
[2]SnapShot:Glioblastoma Multiforme[J].Svetlana Kotliarova,Howard A.Fine.Cancer Cell.2012(5)
[3]Treatment of Brain Metastases:Chemotherapy[J].Sean A.Grimm.Current Oncology Reports.2012(1)
[4]miR‐181b modulates multidrug resistance by targeting BCL2 in human cancer cell lines[J].WeiZhu,XiaShan,TongshanWang,YongqianShu,PingLiu.Int.J.Cancer.2010(11)
[5]李松.甘草酸对人胶质瘤U251细胞的作用及其机制的研究[D].南方医科大学,2014.