背景[1-3]
小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞(NG108-15细胞)是由小鼠N18TG2神经母细胞瘤细胞和大鼠C6-BU-1神经胶质瘤细胞在失活仙台病毒存在下融合而成。生长培养基:DMEM高糖(不含丙酮酸钠)+HAT+10%FBS+1%P/S,培养条件气相:空气,95%;CO2,5%温度:37℃。
小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞
培养步骤:
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞,完全脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于二苯乙烯苷对冈田酸诱导的NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化的干预作用与机制研究
采用冈田酸诱导的NG108-15细胞制备阿尔兹海默病细胞模型,通过检测二苯乙烯苷对诱导的NG108-15细胞中磷酸化的Tau蛋白以及相关磷酸激酶和磷酸酶、磷酸激酶调控因子表达的影响,探讨二苯乙烯苷对阿尔兹海默病细胞模型Tau蛋白磷酸化调控的影响及作用机制。
方法:采用MTT法观察TSG作用于冈田酸诱导的NG108-15细胞24 h时的增殖情况,选取合适的剂量作为造模浓度。取对数生长期的NG108-15细胞,分为正常组、模型组、TSG低、中、高剂量(50、100、200μmol/L)组。利用AO/EB双荧光染色法检测TSG对细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸激酶蛋白CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK,磷酸酶蛋白PP2A、PP2B、PP5和P35、Tau、P-Tau蛋白的表达。RT-PCR法检测CDK5、GSK3β、PP2A、PP2B mRNA的变化。
免疫荧光(Immunofluorescence)检测CDK5、GSK3β、PP2A、PP2B和Tau蛋白表达和分布。采用SPSS软件对正常组、模型组和高、中、低给药组的Tau、P-Tau蛋白,磷酸激酶CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK蛋白、磷酸酶蛋白PP2A、PP2B、PP5和P35、Tau、P-Tau蛋白,磷酸激酶CDK5、GSK3β和磷酸酶蛋白PP2A、PP2B基因之间相关性进行分析。
结果:在MTT实验中,NG108-15细胞随OA浓度升高,存活率下降,当浓度为80nmol/L时,细胞存活率下降明显(P<0.01),细胞衰老皱缩,细胞形态学发生改变,AO/BE荧光染色显示细胞有凋亡产生。
选取80nmol/L作为造模剂量,经给药后,TSG能够增强冈田酸诱导的NG108-15细胞的增殖能力,呈一定的剂量依赖;与模型组比较,TSG能抑制冈田酸对NG108-15细胞的衰老,提高细胞存活率(P<0.05)。
(1)TSG对OA诱导的NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中P-Tau的含量显著升高(P<0.01),TSG给药后与模型组相比,中、高剂量组P-Tau含量下降(P<0.01或P<0.05),免疫荧光检测中,与模型组相比,TSG给药组能减少Tau蛋白的聚集。结果提示,TSG降低OA诱导的NG108-15细胞的Tau磷酸化水平,减少Tau蛋白的聚集程度。
(2)TSG对OA诱导的NG108-15细胞磷酸激酶的影响。Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中磷酸激酶CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK蛋白的表达显著升高(P<0.01),TSG给药后与模型组相比,给药组磷酸激酶CDK5、GSK3β、CK1、MAPK1、JNK、PKA表达降低(P<0.01或P<0.05)。RT-PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组中CDK5和GSK3βmRNA的转录显著增多(P<0.05或P<0.01),TSG能显著下调OA诱导的NG108-15细胞CDK5和GSK3βmRNA的转录(P<0.01)。免疫荧光检测中,与模型组相比,TSG给药组能减少CDK5和GSK3β蛋白的表达。结果提示,TSG能降低磷酸激酶CDK5、GSK3β、CK1、MAPK1、JNK、PKA的表达,从而减轻Tau的磷酸化水平。
参考文献
[1]Okadaic acid–induced tau hyperphosphorylation and the downregulation of Pin1 expression in primary cortical neurons[J].Derya Metin-Arma?an,Duygu Gezen-Ak,Erdin?Dursun,?rem Lütfiye Atasoy,Arzu Karabay,Selma Y?lmazer,Melek?ztürk.Journal of Chemical Neuroanatomy.2018
[2]Aβdimers induce behavioral and neurochemical deficits of relevance to early Alzheimer’s disease[J].Laila Abdel-Hafiz,Andreas Müller-Schiffmann,Carsten Korth,Benedetta Fazari,Owen Y.Chao,Susanne Nikolaus,Sandra Sch?ble,Arne Herring,Kathy Keyvani,Valéria Lamounier-Zepter,Joseph P.Huston,Maria A.de Souza Silva.Neurobiology of Aging.2018
[3]New cholinesterase inhibitors for Alzheimer’s disease:Structure activity relationship,kinetics and molecular docking studies of 1–butanoyl–3–arylthiourea derivatives[J].Fayaz Ali Larik,Muhammad Shakil Shah,Aamer Saeed,Hamid Saeed Shah,Pervaiz Ali Channar,Michael Bolte,Jamshed Iqbal.International Journal of Biological Macromolecule.2018
[4]Tau in Alzheimer’;s Disease:Mechanisms and Therapeutic Strategies[J].Yu Gao,Lin Tan,Jin-Tai Yu,Lan Tan.Current Alzheimer Research.2018(3)
[5]谭俊杰.二苯乙烯苷对冈田酸诱导的NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化的干预作用与机制研究[D].广西中医药大学,2019.