背景[1-3]
液体培养基是微生物或动植物细胞的液状培养基。它具有进行通气培养、振荡培养的优点。在静止的条件下，在菌体或培养细胞的周围，形成透过养分的避障，养分的摄入受到阻碍。由于在通气或在振荡的条件下，可消除这种阻碍以及增加供氧量，所以有利于细胞生长，提高生产量。
液体培养基
牛肉膏蛋白胨液体培养基：(又称营养肉汤，用于培养细菌)
成分：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g,蒸馏水(或去离子水)1000mL,pH7.4士0.2.
制法：将各成分溶解于水中，于20~25℃条件下以1mol/LNaOH溶液用pH计校正pH7.4,分装三角瓶(装量以三角瓶容积的1/2~2/3为宜)，或试管(分装量以试管高度的1/4左右为宜),0.1MPa灭菌15~20min后备用。
LB液体培养基：(用于培养细菌，常在分子生物学中应用)
成分：胰蛋白陈10g、酵母膏5g.NaCl10g、琼脂15~20g,双蒸馏水1000mL，pH7.0
制法：将各成分溶于1000mL双蒸馏水中，用1mol/LNaOH(约1mL)调节pH,分装后，0.IMPa灭菌15-20min。必要时也可在培养基中加入0.1%葡萄糖。半固体培养基加入0.4%-0,5%琼脂。
豆芽汁液体培养基：(用于培养酵母菌和霉菌及霉菌原生质体融合)
成分：豆芽汁1000mL、磷酸氢二铵1g.KCl 0.2g、MgSO4.7H2O,0.2g.pH6.2-6.4.
制法：将固体成分于豆芽汁中加热溶解，校正pH,如果配制固体培养基再加人15-20g琼脂，分装三角瓶或试管，0.07MPa灭菌20min。
豆芽汁制备：将黄豆或绿豆用水浸泡一夜，置于室温(20℃左右)下，上覆盖湿布，每天冲洗1~2次，弃去腐烂不发芽者，待发芽至1寸左右即可。将黄豆芽或绿豆芽200g洗净，在1000mL水中煮沸30min，纱布过滤得豆芽汁，补足水分至1000mL,此即为20%的豆芽汁。
应用[4][5]
用于土壤微生物的筛选及其次级代谢产物的研究
微生物来源的先导化合物因其来源丰富、结构独特等优势在药物开发中占有不可估量的作用。然而,近年来随着抗生素在临床以及其他领域的广泛应用,细菌耐药性日益严峻。但近50年来,仅有利奈唑烷和达托霉素两种新型结构的抗生素投入到临床实践中来,这在很大程度上提示了人类对新抗生素的研发迫在眉睫。
以土壤为材料,从中筛选具有抑菌活性的微生物,然后进行发酵、分离纯化得到目标化合物,对其进行抗菌活性研究,最后进行化合物结构鉴定及产生菌的菌种鉴定。
以采自国内不同地区的5份土壤作为分离对象,共分离到197株菌,其中细菌96株,真菌43株,放线菌58株。对分离到的菌株进行发酵培养,然后采用杯碟法,对发酵产物进行抗菌活性测定得到21株具有抑菌活性的菌株。结合抑菌活性及HPLC图谱,确定SIPI-2014406为主要研究菌株。采用大孔吸附层析、反相C18层析对SIPI-2014406菌株的发酵液进行纯化,得到化合物018和009。化合物018的纯度98.3%,化合物009纯度99.6%。抑菌活性测定表明:化合物009与发酵液抑菌谱相似,为广谱抗菌作用。但是化合物018的抑菌谱有所不同,对阴性菌抑菌作用更为敏感。
采用常量肉汤微量测定化合物018、009对敏感菌株的MIC,化合物009对各种受测菌株抑制作用微弱;化合物018对阴性菌有明显抑制作用,对阳性菌及真菌作用微弱。氨基酸测定表明化合物009、018均含有氨基酸:D-Ser、L-Thr、L-Asp、D-Asp、L-Glu、L-Pro、D-Tyr。综合氨基酸组成、质谱、二级质谱和核磁共振分析及相关参考文献推断化合物009为normal-C14 bacillomycin D,分子式为C48H74N10O15,并确定其结构式;化合物018分子式为C50H78N10O15,结构式有待进一步研究。
基于16S r DNA序列的系统发育分析表明:该菌株SIPI-2014406与一株Bacillus sp.DOA6（芽孢杆菌DOA6）同源性较高,二者形态特征和理化特性相似度也较高,初步鉴定为芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.SIPI-2014406。本研究表明枯草芽孢杆菌SIPI-2014406能够产生杆菌霉素类化合物,同时C16杆菌霉素D经抑菌活性测试发现其对革兰氏阴性菌具有抑制作用的新的功能。
参考文献
[1]Global antibiotic consumption 2000 to 2010:an analysis of national pharmaceutical sales data[J].Thomas P Van Boeckel,Sumanth Gandra,Ashvin Ashok,Quentin Caudron,Bryan T Grenfell,Simon A Levin,Ramanan Laxminarayan.The Lancet Infectious Diseases.2014(8)
[2]Antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae,including molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamase–producing species,in urinary tract isolates from hospitalized patients in North America and Europe:results from the SMART study 2009–2010[J].Daryl J.Hoban,Christine Lascols,Lindsay E.Nicolle,Robert Badal,Sam Bouchillon,Meredith Hackel,Stephen Hawser.Diagnostic Microbiology&Infectious Disease.2012(1)
[3]Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India,Pakistan,and the UK:a molecular,biological,and epidemiological study[J].Karthikeyan K Kumarasamy,Mark A Toleman,Timothy R Walsh,Jay Bagaria,Fafhana Butt,Ravikumar Balakrishnan,Uma Chaudhary,Michel Doumith,Christian G Giske,Seema Irfan,Padma Krishnan,Anil V Kumar,Sunil Maharjan,Shazad Mushtaq,Tabassum Noorie,David L Paterson,Andrew Pearson,Claire Perry,Rachel Pike,Bhargavi Rao,Ujjwayini Ray,Jayanta B Sarma,Madhu Sharma,Elizabeth Sheridan,Mandayam A Thirunarayan,Jane Turton,Supriya Upadhyay,Marina Warner,William Welfare,David M Livermore,Neil Woodford.The Lancet Infectious Diseases.2010(9)
[4]Unexpected applications of secondary metabolites[J].Preeti Vaishnav,Arnold L.Demain.Biotechnology Advances.2010(2)
[5]闫大壮.土壤微生物的筛选及其次级代谢产物的研究[D].上海师范大学,2015.