背景[1-3]
生物素标记试剂盒是一种通过随机引物标记反应产生生物素标记DNA探针的试剂盒。本试剂盒标记的生物素DNA探针可以用于常规的Northern、Southern、colony或plaque hybridization、dot或slot blot、原位杂交等。
在Klenow酶(Klenow fragment,3'-5'exo-)催化下，通过随机引物标记反应(random prime labeling)可以把生物素标记的Biotin-11-dUTP掺入到新合成的DNA探针中，这样就可以产生生物素标记的DNA探针。在随机引物标记反应过程中，一些标记好的DNA探针可以被Klenow酶从模板DNA链上驱赶下来。这样在模板量较少的情况下，通过随机引物标记反应，最后可以产生比模板DNA量更多的生物素标记DNA探针，可多达1-15倍左右。
生物素标记试剂盒可以用于多种DNA模板的标记，包括DNA片段、线性化的质粒或cosmid、超螺旋DNA等。用于本试剂盒的模板DNA片段应不小于100bp，小于100bp的DNA模板可以使用生物素3'末端DNA标记试剂盒(D3106)进行DNA探针标记。
生物素标记试剂盒
使用说明：
1.在一离心管或PCR管内加入100ng-1μg DNA模板，再加入适量试剂盒提供的Ultrapure Water，至总体积为34μl。
说明：通常100-300ng DNA模板已经足够用于一次标记反应。
2.加入10μl Random Primer in Buffer(5X)，混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心数秒使所有液体集中在管底。
3.沸水浴加热5分钟，或在PCR仪上100℃加热5分钟(如果不能设置100℃，99℃加热5分钟也完全可以)。
4.立即放置到预先准备好的冰水浴中至少2-3分钟。
5.加入5μl Biotin-Labeling Mix。
6.加入1μl Klenow Fragment，混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心数秒使所有液体集中在管底。
7.37℃孵育1小时或过夜(不宜超过20小时)。37℃孵育过夜可以显著增加生物素标记DNA的产量，因此推荐孵育过夜(12-20)小时。
8.加入3μl探针标记终止液，混匀，终止标记反应。至此标记反应已经全部完成，标记好的DNA可以-20℃保存。
9.此时探针可以直接用于探针标记效率的检测及Southern、Northern等后续操作。
应用[4][5]
用于生物素标记的三种天然产物分子探针的设计与合成研究
从中药中提取分离得到的天然产物具有结构多样、药理作用广泛的特点,常被用来作为先导化合物开发新药,因此需要对其具体作用机制进行研究。天然产物药理作用广泛对应着多靶点的特性,但其靶标蛋白的难以确定也阻碍了人们对其的进一步研究与开发。
基于亲和性蛋白组学分析方法（Affinity-based Protein Profiling,ABPP）是基于活性小分子与靶标蛋白之间的亲和作用,在活性小分子上引入报告基团,利用亲和层析技术可以将靶标蛋白进行分离的一种方法,其作为一种十分有效的工具被广泛应用于天然产物靶标蛋白的发现。
选取三个从中药中提取分离得到的活性天然小分子,设计合成相应的小分子探针,旨在为它们靶标蛋白的发现以及作用机制的研究提供一个有效的工具,具体内容如下:1、对目前主要的用于天然小分子的靶标蛋白鉴定方法进行了介绍,且着重介绍了ABPP方法及其在天然产物靶标蛋白鉴定的应用。
2、以薯蓣皂苷元和生物素为原料,经过酯化、酰胺化、取代、水解反应等步骤分别合成含有长臂亲脂性链和亲水性链的薯蓣皂苷元生物素标记探针3和8,并以MTT法对其进行抗肿瘤活性评价。实验得到的探针分子、重要中间体用MS、1H-NMR、13C-NMR表征,确认所得化合物结构与目标化合物一致。细胞活性实验结果表明合成的探针分子3和8具有与薯蓣皂苷元相当的抗肿瘤活性,且对探针分子标记的靶标蛋白进行电泳分析,发现了三条薯蓣皂苷元可能特异性作用的蛋白条带,这些结果都为后续薯蓣皂苷元抗肿瘤靶标蛋白的发现奠定基础。
3、以三七总皂苷为原料,选取甘油做溶剂,在高温235℃,氢氧化钠存在的条件下,进行碱降解分离得到20（S）-原人参二醇与20（S）-原人参三醇,可以用于下一步合成方法的原料。分别以20（S）-原人参二醇与20（S）-原人参三醇为原料,依照第二章的方法设计合成了生物素标记的两种活性小分子探针。发现酯化反应时,20（S）-原人参三醇的碳3位和碳6位的羟基没有选择性,故合成了分别在碳3位和碳6位进行取代的生物素化原人参三醇。
参考文献
[1]Neuroprotective effects of 20（S）‐protopanaxatriol（PPT）on scopolamine‐induced cognitive deficits in mice[J].Cong Lu,Jingwei Lv,Liming Dong,Ning Jiang,Yan Wang,Qiong Wang,Yinghui Li,Shanguang Chen,Bei Fan,Fengzhong Wang,Xinmin Liu.Phytotherapy Research.2018(6)
[2]Protopanaxadiol derivative DDPU improves behavior and cognitive deficit in AD mice involving regulation of both ER stress and autophagy[J].Xiaodan Guo,Jianlu Lv,Jian Lu,Lei Fan,Xi Huang,Lihong Hu,Jiaying Wang,Xu Shen.Neuropharmacology.2018
[3]Metabolic analysis of Panax notoginseng saponins with gut microbiota-mediated biotransformation by HPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS[J].Man-Yun Chen,Li Shao,Wei Zhang,Chong-Zhi Wang,Hong-Hao Zhou,Wei-Hua Huang,Chun-Su Yuan.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.2018
[4]Highly selective inhibition of IMPDH2 provides the basis of antineuroinflammation therapy[J].Li-Xi Liao,Xiao-Min Song,Li-Chao Wang,Hai-Ning Lv,Jin-Feng Chen,Dan Liu,Ge Fu,Ming-Bo Zhao,Yong Jiang,Ke-Wu Zeng,Peng-Fei Tu.Proceedings of the National Academy of Sciences.2017(29)
[5]王平.生物素标记的三种天然产物分子探针的设计与合成[D].昆明理工大学,2019.