背景[1-3]
大鼠肌酸激酶B型(CKB)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中大鼠肌酸激酶B型(CKB)含量。试剂盒性能：1.检测范围：0.625 U/mL–20 U/mL。
2.灵敏度：最低检测浓度小于0.1 U/mL。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠肌酸激酶B型(CKB)水平。用纯化的大鼠肌酸激酶B型(CKB)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入大鼠肌酸激酶B型(CKB)，再与HRP标记的大鼠肌酸激酶B型(CKB)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠肌酸激酶B型(CKB)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠肌酸激酶B型(CKB)浓度。
大鼠肌酸激酶B型(CKB)ELISA试剂盒
操作步骤
1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9）在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于肌酸激酶对上皮性卵巢癌转移及NF-κB信号通路活性影响的研究
脑型肌酸激酶（Creatine Kinase Brain-type,CKB）在乳腺癌、卵巢癌、大肠癌及结肠癌等多种癌症中的表达呈现上调趋势,前期研究发现敲低CKB可以抑制卵巢癌细胞的生长代谢状态。NF-κB信号通路可以参与一系列与炎症发生、免疫应答相关基因的调控,该通路中的核心蛋白NF-κB主要以p65/p50二聚体的形式存在,作为转录因子在癌症的发生、发展中起着重要的作用。生物信息学预测CKB很有可能参与NF-κB信号通路的调控。
在此前的研究基础上,探究CKB对卵巢癌转移的影响,揭示CKB对细胞信号通路NF-κB的调控作用。主要研究结果如下:（1）CKB调控NF-κB信号通路的活性。以卵巢癌SKOV3细胞株为材料,通过RNA干涉技术转染si RNA敲低CKB的表达,发现多个与癌症转移相关基因的表达产物发生了显著的下调,这些基因大多数是NF-κB信号通路的下游基因,特别是NF-κB信号通路核心蛋白p65的水平也发生下调,而通过转染质粒过表达CKB后,则p65蛋白的水平呈现上调的趋势。SKOV3细胞中具有活性的磷酸化的p65和IκB的变化与CKB的变化一致,这表明改变CKB蛋白的表达会调控NF-κB信号通路的活性。
（2）CKB通过影响p65蛋白泛素化水平调控NF-κB信号通路的活性。q RT-PCR结果显示,SKOV3细胞中上调或下调CKB蛋白的表达对p65蛋白的转录没有明显影响;而下调CKB蛋白的表达同时抑制新生蛋白质的合成,p65蛋白的半衰期缩短,上调CKB蛋白的表达则反之。Western blot结果证明,下调CKB蛋白表达增加了p65蛋白的泛素化的修饰程度,这说明敲低CKB可改变p65蛋白泛素化修饰加快其降解,从而降低NF-κB信号通路的活性。
（3）CKB与p65蛋白的RHD结构域相互作用影响p65泛素化。免疫共沉淀实验表明,CKB蛋白和p65蛋白在SKOV3细胞中互作;利用带His标签的p65蛋白进行镍柱亲和结合实验,结果表明CKB能够与p65蛋白专一结合。进一步将p65的两个结构域RHD和CTD分别构建在质粒上转染SKOV3细胞,免疫共沉淀结果表明,只有RHD结构域可以与CKB结合,此结构域也是E3泛素连接酶（ING4或PPARγ）与p65的结合部位,在SKOV3细胞中上调CKB蛋白的表达,阻碍了这两种E3泛素连接酶与p65的结合,这些结果表明p65的RHD结构域与CKB的结合,在调控p65蛋白的泛素化降解过程中发挥了重要作用。
（4）调控CKB蛋白的表达影响卵巢癌细胞体外迁移和侵袭。为了探究CKB蛋白的表达是否对SKOV3细胞迁移和侵袭有影响,我们利用慢病毒感染的方法构建了稳定敲低CKB蛋白表达的卵巢癌细胞（CKB-/--SKOV3）,伤口愈合实验和Transwell小室迁移实验都表明,该细胞株在下调CKB蛋白表达后,细胞的迁移率发生了显著降低。Matrigel侵袭实验结果显示,敲低CKB蛋白的表达也抑制了细胞的侵袭能力。
参考文献
[1]Extracellular Metabolic Energetics Can Promote Cancer Progression[J].Jia Min Loo,Alexis Scherl,Alexander Nguyen,Fung Ying Man,Ethan Weinberg,Zhaoshi Zeng,Leonard Saltz,Philip B.Paty,Sohail F.Tavazoie.Cell.2015(3)
[2]Knockdown of creatine kinase B inhibits ovarian cancer progression by decreasing glycolysis[J].Xu-Hui Li,Xiang-Jun Chen,Wen-Bin Ou,Qian Zhang,Zhi-Rong Lv,Yi Zhan,Long Ma,Tao Huang,Yong-Bin Yan,Hai-Meng Zhou.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2013
[3]Wdr5 Mediates Self-Renewal and Reprogramming via the Embryonic Stem Cell Core Transcriptional Network[J].Yen-Sin Ang,Su-Yi Tsai,Dung-Fang Lee,Jonathan Monk,Jie Su,Kajan Ratnakumar,Junjun Ding,Yongchao Ge,Henia Darr,Betty Chang,Jianlong Wang,Michael Rendl,Emily Bernstein,Christoph Schaniel,Ihor R.Lemischka.Cell.2011(2)
[4]RING Domain E3 Ubiquitin Ligases[J].Raymond J.Deshaies,Claudio A.P.Joazeiro.Annual Review of Biochemistry.2009
[5]徐文飞.肌酸激酶对上皮性卵巢癌转移及NF-κB信号通路活性影响的研究[D].山东农业大学,2016.