背景[1-3]
人硫氧化还原蛋白(TRX)ELISA试剂盒用于检测血浆，血清及相关液体等样本中人硫氧化还原蛋白(TRX)的含量。
检测原理：双抗体夹心法测定标本中人硫氧化还原蛋白(TRX)水平。用纯化的人硫氧化还原蛋白(TRX)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人硫氧化还原蛋白(TRX)，再与HRP标记的人硫氧化还原蛋白(TRX)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人硫氧化还原蛋白(TRX)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人硫氧化还原蛋白(TRX)浓度。
人硫氧化还原蛋白(TRX)ELISA试剂盒
操作步骤：
1、取出试剂盒,室温(20-25℃)放置30分钟。
2、分组:取出96孔板,根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔,1个空白对照
3、标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100ul,然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100ul,弃掉。第六只试管作为0号标准品。
4、加样:依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中;空白对照孔加入50ul的蒸馏水;其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
5、温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
6、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒弃去,如此重复5次,拍干。
7、加酶标溶液:标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液(空白对照孔除外)。
8、温育:酶标板用封板纸密封后,放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。
9、洗板:用稀释后的洗涤液注满每孔,静置15-30s,充分清洗酶标板5次,用吸水纸彻底拍干。
10、显色:各孔加入显色剂A液50ul后,再加入显色剂B液50ul。
11、终止:25-37℃下避光反应10-15分钟,加入50ul终止液。
12、读板:在450nm波长读取各孔的OD值。
应用[4][5]
用于硫氧化还原蛋白在胰腺癌及癌旁组织中的表达及意义研究
自从发现硫氧还蛋白以来，越来越多的证据表明，硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶以及NADPH一起协同作用，组成一个广谱的蛋白二硫键还原体系，在稳定细胞内氧化还原环境、保持细胞免受有害的氧化压力的刺激以及调节蛋白-蛋白、蛋白-核酸相互作用等方面起重要作用。而且，细胞的氧化还原状态与一些疾病的发生（如艾滋病、肿瘤、缺血性疾病）密切相关。在人类的多种肿瘤中均存在硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的异常表达，对于肿瘤发生机制的研究及抗癌药物的开发，硫氧化还原系统提供了一个颇有吸引力的靶标，成为国际上研究的热点。
实验方法采用RT-PCR检测胰腺癌及癌旁组织中Trx-1的mRNA含量，采用Western blotting检测胰腺癌及癌旁组织中Trx-1的蛋白表达量。统计学处理用SPSS13.0软件完成，计量资料数据表示方式以平均值±标准差（Mean±SD），两组计量资料采用非独立样本t检验，各组指标间的相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学显著性意义。
结果Western blotting：30例癌组织24例中Trx-1过表达，23例癌旁组织Trx-1低表达。采用Kodak DNA Analysis 1D图像分析软件进行光密度分析，读取癌及癌旁组织Trx-1目的条带和β-actin目的条带的光密度值，分别计算Trx-1表达量RI值，RI=Trx-1条带光密度值／β-actin条带光密度值。
使用t检验进行Trx-1在癌及癌旁组织中的表达量比较。24例胰腺癌组织光密度值（0.81±0.10）明显高于癌旁组织光密度值（0.30±0.11）（P=0.000）。胰腺癌组织中Trx-1表达量与分化程度无关，高分化与中低分化无显著性差异（P=0.08）。而与肿瘤TNM分期有关，Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期胰腺癌组织的Trx-1表达量有显著性差异（P=0.003）。RT-PCR：30例癌组织26例中Trx-1过表达，25例癌旁组织Trx-1低表达。
采用Kodak DNA Analysis 1D图像分析软件进行光密度分析，读取癌及癌旁组织Trx-1和β-actin目的条带的光密度值，分别计算Trx-1 mRNA指数RI，RI=Trx-1 mRNART-PCR产物光密度值／β-actin mRNA RT-PCR产物光密度值。RI反映Trx-1 mRNA在癌及癌旁组织的相对表达强度。使用t检验进行Trx-1 mRNA在癌及癌旁组织的表达量比较。26例胰腺癌组织RI值（0.80±0.08）明显高于癌旁组织RI值（0.39±0.15）（P=0.000）。
胰腺癌组织中Trx-1 mRNA表达量与分化程度无关，高分化与中低分化的RI值无显著性差异（P=0.40）。与TNM分期有关，Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期胰腺癌组织的Trx-1 mRNA表达量有显著性差异（P=0.000）。
参考文献
[1] EIevated serum level of Thioredoxin in patients with Hepatocellular Carcinoma[J].Kunihisa Miyazaki,Noriko Noda,Shuichi Okada,Yoshiaki Hagiwara,Michio Miyata,Ikunosuke Sakurabayashi,Naohito Yamaguchi,Takashi Sugimura,Masaaki Terada,Hiro Wakasugi.Biotherapy.1998(4)
[2] Regulation of apoptosis in immune cells[J].J.D.Mountz,T.Zhou,J.Wu,W.Wang,X.Su,J.Cheng.Journal of Clinical Immunology.1995(1)
[3] mmunohistochemical localization of adult T-cell leukaemia-derived factor,a human thioredoxin homologue,in human fetal tissues[J].Shingo Fujii,Yoshihiko Nanbu,Ikuo Konishi,Takahide Mori,Hiroshi Masutani,Junji Yodoi.Virchows Archiv A Pathological Anatomy and Histopathology.1991(4)
[4] Differential expression of hepatic apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,a DNA repair enzyme,in chronic hepatitis[J].Shinichi Sumiyoshi,Yoshimasa Kobayashi,Kinya Kawamura,Kazuhito Kawata,Hirotoshi Nakamura.World Journal of Hepatology.2013(04)
[5]王建军.硫氧化还原蛋白在胰腺癌及癌旁组织中的表达及意义[D].浙江大学,2007.