背景[1-3]
NCI-H460人大细胞肺癌细胞是从一位大细胞肺癌患者的胸水中建立的。NCI-H460细胞表达的p53 mRNA易于检测，水平与正常肺细胞相当，未表现出NCI-H460细胞DNA总体结构异常。NCI-H460细胞角蛋白和波形蛋白纤维染色阳性；神经丝三联体蛋白阴性。
NCI-H460人大细胞肺癌细胞
培养步骤：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。
应用[4][5]
用于尼古丁对NCI-H1975和NCI-H460细胞促进增殖作用及对PI3K/Akt通路的影响研究
探讨尼古丁对不同病理来源NSCLCs作用差异和可能机制,为建立寻找针对不同病理类型NSCLCs治疗提供理论依据。方法:分别利用CCK-8细胞毒性试剂盒及流式细胞术检测尼古丁对人肺腺癌细胞NCI-H1975和人大细胞肺癌细胞NCI-H460的促进增殖和抑制凋亡作用。利用Western blot和RT-PCR技术检测尼古丁作用后NCI-H1975和NCI-H460细胞PI3K/Akt通路关键基因m RNA及蛋白表达的改变,建立尼古丁对不同病理类型NSCLCs细胞作用产生差异的分子机制。
结果:1、CCK-8检测结果显示尼古丁对NCI-H1975、NCI-H460细胞均有促进增殖的作用,与对照组具有统计学意义（P<0.05）,具有时间依赖性（NCI-H1975,y=102.5e0.056x,R2=0.982;NCI-H460,y=102.5e0.056x,R2=0.976）及剂量依赖性（NCI-H1975,y=11.72ln（X）+100.4,R2=0.994;NCI-H460,y=10.90ln（x）+99.68,R2=0.996）,但NCI-H1975对尼古丁反应更迅速,更敏感,变化更大。
2、流式细胞术检测结果显示尼古丁能显著降低顺铂导致的NCI-H1975、NCI-H460细胞凋亡（P<0.05）,具有时间依赖性（NCI-H1975,y=66.48x0.84,R2=0.979;NCI-H460,y=63.98x0.84,R2=0.985）,但NCI-H1975对尼古丁反应更迅速,更敏感,变化更大。
3、Western blot及RT-PCR检测结果显示尼古丁干预后随尼古丁浓度增大NCI-H1975细胞PI3K m RNA表达增加、Bad/Caspase 9/Fox O3a/m TOR m RNA表达下降,随尼古丁浓度增大NCI-H1975细胞PI3K/p-Akt/p-Bad/p-Caspase9/p-Fox O3a/p-m TOR蛋白表达增加、Bad/Fox O3a/m TOR表达下降;随尼古丁作用时间增加NCI-H1975细胞PI3K m RNA表达增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表达下降,随尼古丁作用时间增加NCI-H1975细胞PI3K蛋白表达增加、Bad/Caspase9/Fox O3a/m TOR表达下降。尼古丁干预后随尼古丁浓度增大NCI-H460细胞PI3K m RNA表达增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表达下降,随尼古丁浓度增大NCI-H460细胞PI3K/p-Akt/p-Bad/p-m TOR蛋白表达增加、Bad/Fox O3a/m TOR表达下降;随尼古丁作用时间增加NCI-H460细胞PI3K m RNA表达增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表达下降,随尼古丁作用时间增加NCI-H460细胞PI3K蛋白表达增加、Bad/Fox O3a/m TOR表达下降。
4、尼古丁对NCI-H1975、NCI-H460细胞Caspase 9和Fox O3a两蛋白作用出现差异。
结论:1、尼古丁对NCI-H1975、NCI-H460细胞有促进增殖和抑制凋亡作用,且作用具有剂量依赖性和时间依赖性。
2、NCI-H1975和NCI-H460细胞对尼古丁反应不同。
3、尼古丁可能通过调节PI3K/Akt通路下游Bad、Caspase 9、Fox O3a、m TOR基因表达水平及磷酸化水平来调节NCI-H1975和NCI-H460细胞增殖与凋亡。
参考文献
[1]Risk factor analysis of locoregional recurrence after sublobar resection in patients with clinical stage IA non–small cell lung cancer[J].Terumoto Koike,Teruaki Koike,Katsuo Yoshiya,Masanori Tsuchida,Shin-ichi Toyabe.The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery.2013(2)
[2]Investigational agents in development for the treatment of ovarian cancer[J].Shannon N.Westin,Thomas J.Herzog,Robert L.Coleman.Investigational New Drugs.2013(1)
[3]Development of PI3K/AKT/mTOR Pathway Inhibitors and Their Application in Personalized Therapy for Non–Small-Cell Lung Cancer[J].Vassiliki Papadimitrakopoulou.Journal of Thoracic Oncology.2012(8)
[4]Role of Apollon in Human Melanoma Resistance to Antitumor Agents That Activate the Intrinsic or the Extrinsic Apoptosis Pathways[J].Elena Tassi,Marina Zanon,Claudia Vegetti,Alessandra Molla,Ilaria Bersani,Valentina Perotti,Marzia Pennati,Nadia Zaffaroni,Michele Milella,Soldano Ferrone,Carmelo Carlo-Stella,Alessandro M.Gianni,Roberta Mortarini,Andrea Anichini.Clinical Cancer Research.2012(12)
[5]许雅鑫.尼古丁对NCI-H1975和NCI-H460细胞促进增殖作用及对PI3K/Akt通路的影响研究[D].山西医科大学,2015.