背景[1-3]
D407人视网膜色素上皮细胞分离自视网膜组织;视网膜色素上皮(RPE)位于脉络膜和光感受器细胞外节之间,是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道;主要是由单层色素上皮细胞所构成,排列十分规则。人视网膜色素上皮参与视黄醇循环,吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性,并分泌多种生长因子,帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。细胞呈多角形,细胞分为三部分,即顶部、体部和基底部。
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D407人视网膜色素上皮细胞
细胞培养步骤:
一.培养基及培养冻存条件准备:
1)准备DMEM培养基(DMEM:GIBCO,货号12800017,添加NaHCO3 1.5g/L),90%;优质胎牛血清,10%。
2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液:90%完全培养基,10%DMSO,现用现配。液氮储存。
二.细胞处理:
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时,弃去培养基后加入少量胰酶,细胞变圆脱落后,加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中,再添加10%DMSO后进行冻存。
应用[4][5]
用于IL-33在β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞中的表达及作用机制研究
以IL-33作为主要研究对象,研究其在β-淀粉样蛋白(Aβ)刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性。2.初步探明IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制。
方法:1.IL-33在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性研究采用MTT法检测不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞后不同时间点的细胞存活率,观察其对视网膜色素上皮细胞损伤的影响。提取不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞24h后细胞RNA,采用定量PCR检测IL-33mRNA水平;收集细胞培养上清,ELISA检测IL-33蛋白表达;加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂后,采用定量PCR及ELISA检测0.3μMAβ1-40刺激D407细胞24h后IL-33mRNA及蛋白水平表达,鉴定β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞后调控产生IL-33的信号通路。
2. IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究采用定量PCR检测不同浓度的IL-33刺激D407细胞16h后其受体ST2LmRNA表达情况,流式细胞术检测100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后细胞表面受体ST2L表达;不同浓度的IL-33刺激D407细胞16h后,收集细胞及培养上清,定量PCR和ELISA检测炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-αmRNA和蛋白表达,探讨IL-33因子对D407细胞的作用机制;加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂后,采用定量PCR及ELISA检测100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后上述炎症因子的表达,鉴定调控产生炎症因子的信号通路。
结果:1.IL-33在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性研究1.1 10.3μM Aβ1-40刺激组较正常组细胞形态变圆,胞体肿胀,细胞排列数量减少,细胞间间隙增加,且随Aβ1-40刺激浓度增加变化明显,而小于0.3μM Aβ1-40刺激组细胞形态无明显变化。MTT检测结果表明:随着Aβ1-40刺激浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,除了0.001μMAβ1-40刺激组外,其余各刺激组与正常对照组相比细胞存活率均显著降低(P<0.05)。随着0.3μM和1μM Aβ1-40刺激D407细胞时间的延长,细胞存活率也逐渐下降,且与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。
1.2不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞后,IL-33mRNA及蛋白表达水平均增加,且在0.3μM刺激浓度时表达显著增加(P<0.05)。结果提示:Aβ1-40刺激D407细胞后能够引起IL-33表达上调。
1.3加入ERK1/2和p38MAPK信号通路抑制剂,0.3μM Aβ1-40刺激D407细胞24h后,IL-33mRNA表达水平显著降低(P<0.05),但只有加入ERK1/2信号通路抑制剂后,细胞培养上清IL-33蛋白水平才有明显下降(P<0.05)。结果提示:Aβ1-40刺激D407细胞后,IL-33的产生主要是通过ERK1/2信号通路调控,而p38MAPK信号通路仅参与了IL-33转录水平的调控。
3. IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究
2.1IL-33因子刺激D407细胞后,ST2L mRNA表达显著增加(P<0.05),并随着IL-33刺激浓度的增加而增加,且在100ng/ml IL-33刺激时表达量最高。采用流式细胞术检测D407细胞表面受体表达结果显示:D407细胞表面ST2L表达阳性,且在100ng/ml IL-33因子刺激细胞16h后表达上调。
2.2采用定量PCR及ELISA检测IL-33因子刺激D407细胞后炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-αmRNA及蛋白水平表达。结果显示:20,50,100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后,炎症因子mRNA及蛋白水平表达均显著增加(P<0.05),且随着IL-33因子刺激浓度的增加,炎症因子表达均逐渐增加,并在100ng/mlIL-33刺激时表达量最高。结果提示:IL-33刺激D407细胞后IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α因子表达上调。
2.3加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂,100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后,定量PCR和ELISA检测炎症因子mRNA及蛋白水平表达,结果显示:加入p38MAPK信号通路抑制剂后,IL-6表达显著下降;加入ERK1/2信号通路抑制剂后,IL-8表达显著下降;加入NF-κB信号通路抑制剂后,IL-1β表达显著下降;而加入JNK信号通路抑制剂后,TNF-α表达显著下降(P<0.05)。结果表明:IL-33因子刺激D407细胞后炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α的产生是分别通过p38MAPK,ERK1/2,NF-κB以及JNK信号通路调控。
参考文献
[1]Tetrandrine suppresses amyloid-β-induced inflammatory cytokines by inhibiting NF-κB pathway in murine BV2 microglial cells[J].Fu Qian He,Bo Yun Qiu,Tian Ke Li,Qin Xie,De Jun Cui,Xiao Li Huang,Hua Tian Gan.International Immunopharmacology.2011(9)
[2]IL-33 exacerbates eosinophil-mediated airway inflammation.[J].Stolarski Bartosz,Kurowska-Stolarska Mariola,Kewin Peter,Xu Damo,Liew Foo Y.Journal of immunology(Baltimore,Md.:1950).2010(6)
[3]Increased IL-33 expression by epithelial cells in bronchial asthma[J].David Préfontaine,Jessica Nadigel,Fazila Chouiali,Séverine Audusseau,Abdelhabib Semlali,Jamila Chakir,James G.Martin,Qutayba Hamid.The Journal of Allergy and Clinical Immunology.2010(3)
[4]IL-33 shifts macrophage polarization,promoting resistance against Pseudomonas aeruginosa keratitis.[J].Hazlett Linda D,McClellan Sharon A,Barrett Ronald P,Huang Xi,Zhang Yunfan,Wu Minhao,van Rooijen Nico,Szliter Elizabeth.Investigative ophthalmology&visual science.2010(3)
[5]刘晓萃.IL-33在β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞中的表达及作用机制研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2012.