背景[1-3]
Α-酮戊二酸含量试剂盒用于测定α-酮戊二酸的活性及含量。
原理：通过偶联酶测定法测定Α-酮戊二酸（α-KG）浓度，其产生与存在的α-KG成比例的比色(570nm)/荧光(λex=535/λem=587 nm)产物。
α-酮戊二酸(α-KG)是三羧酸(TCA)循环中的关键中间体，是由异柠檬酸脱氢酶对异柠檬酸的氧化脱脂作用形成的。通过谷氨酸脱氢酶催化谷氨酸合成α-KG是TCA循环的厌氧反应的关键步骤。α-KG是重要的氮转运蛋白。这种α-酮戊二酸测定试剂盒提供了一种简单、灵敏、快速的方法，用于量化各种样品中的α-KG。
Α-酮戊二酸含量试剂盒
产品优点如下：
1、快速简便：全程约50分钟，可测100例左右样本。
2、取样量微：本法取手指或耳垂等末梢血20ul～50ul即可测红细胞中的SOD，只需2ml静脉血可测白细胞中的SOD及血小板中SOD，只需50mg左右组织就可测组织匀浆、胞浆中的SOD，0.2g组织可测线粒体及微粒体中的SOD。
3、灵敏度高：IC50=0.05g/ml，是邻苯三酚法的18倍。
4、稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。
测定步骤：
1.加样
1.除包被外都需45度加样
2.加样体积要准确
3.管底加样，不能加在管壁上
4.加样时不能产生气泡
2.温浴
1.加标本后和加结合物后，应立即放入按规定的反应温度的水浴箱。
2.各ELISA板不应叠在一起。
3.为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的金属湿盒中。
4.加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。
3.洗涤
1.洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。
2.目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
4.读板
1.阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。
2.如用酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。
应用[4][5]
用于全细胞转化生产α-酮戊二酸的研究
以谷氨酸棒杆菌作为生产α-酮戊二酸的出发菌株,利用分子生物学手段和代谢工程理论,对重组谷氨酸棒杆菌株进行代谢工程改造。谷氨酸棒杆菌是一种食品安全级的工业微生物,已被应用于谷氨酸、赖氨酸和精氨酸等多种氨基酸以及有机酸等高附加值产品的工业生产。
近年来,由于对谷氨酸棒杆菌生产α-酮戊二酸生产的研究和α-酮戊二酸的代谢合成机制研究比较缺乏,因此利用谷氨酸棒杆菌合成α-酮戊二酸仍然受到诸多限制,所以采用谷氨酸棒杆菌生产α-酮戊二酸具有较大的潜在优势。
为了降低过氧化氢对细胞造成的损伤,本文筛选了分别来自Pseudomonas putidaNBRC 14164、Pantoea ananatis Y1、E.coli MG1655、C.glutamicum ATCC13032、Bacillus subtilisS1、Shewanella oneidensis MR-1的过氧化氢酶,通过构建L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达的重组菌株进行全细胞转化,从而解决外源添加过氧化氢的问题。
为了提高α-酮戊二酸的转化率,我们构建了双启动子双酶共表达菌株,获得pLGOX-tacKatE重组菌株。同时,为了促进全细胞的转化效率,本研究筛选出2.5%的Triton X-100作为细胞的表面活性剂,以底物浓度250 g/L,菌体浓度OD600为30,35℃的条件下进行全细胞转化48 h后,重组菌体内α-酮戊二酸的转化率达到93.7%,相比于初始菌株提高了26%。
综上所述,本研究通过双酶共表达以及增强启动子表达的策略,构建了谷氨酸棒杆菌α-酮戊二酸合成细胞工厂,实现了α-酮戊二酸高效的全细胞转化。通过实验探究,本文实现了α-酮戊二酸的增加,并且节约了成本,实现了绿色友好的生产方式,为今后工业化转化α-酮戊二酸的大规模生产提供了借鉴和理论指导。
参考文献
[1]Genotoxicity and acute toxicity evaluation of the three amino acid additives with Corynebacterium glutamicum biomass[J].Ki-Young Kang,Min-Sub Kim,Min-Seung Lee,Jeong-Ja Oh,Seulgi An,Dhanbee Park,In Kyoung Heo,Hyun-Kul Lee,Si-Whan Song,Sun-Don Kim.Toxicology Reports.2020
[2]One-Pot Biosynthesis of l-Aspartate from Maleate via an Engineered Strain Containing a Dual-Enzyme System.[J].Liu Zhongmei,Yu Long,Zhou Li,Zhou Zhemin.Applied and environmental microbiology.2019(19)
[3]A one pot,one step,precision cloning method with high throughput capability.[J].Carola Engler,Romy Kandzia,Sylvestre Marillonnet.PLoS ONE.2017(11)
[4]Golden gate shuffling:a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.[J].Carola Engler,Ramona Gruetzner,Romy Kandzia,Sylvestre Marillonnet.PLoS ONE.2017(5)
[5]张雪.全细胞转化生产α-酮戊二酸的研究[D].天津科技大学,2020.