背景[1-3]
真核肽链释放因子1抗体是可以特异性真核肽链释放因子1的多克隆抗体,主要用于体外检测真核肽链释放因子1的免疫学实验。
在大多数生物中,64个密码子中的三个(UAA,UAG和UGA)用作翻译终止信号,称为终止密码子(termination codon),也叫无义密码子(nonsense codon)。与有义密码子不同,终止密码子的识别不依赖于tRNA,而是通过I类释放因子进行的。
参与翻译起始的蛋白因子称为起始因子,参与延伸的叫延伸因子(eIF5A除外)。而参与翻译终止的因子换了个名字,叫做释放因子(release factor,RF)。这是因为它们参与新生肽链的释放过程。
真核肽链释放因子1抗体
释放因子分为两类,I类因子负责终止密码子识别和肽基tRNA水解。II类因子具有GTP酶活性,可以辅助I类因子进入PTC(肽基转移酶中心)。
原核生物的I类释放因子是RF1和RF2,前者识别UAA和UAG,后者识别UAA和UGA。真核生物和古细菌都只有一个I类因子,真核的叫做eRF1,古细菌的叫aRF1。eRF1和aRF1彼此同源,但是与细菌的几乎没有序列同源性。
释放因子(release factor,RF):识别终止密码子引起完整的肽链和核糖体从mRNA上释放的蛋白质。单一因子以数字排列,真核生物细胞的因子称为eRF/RF。
释放因子使多肽链与tRNA之间的酯键水解,释放多肽链,消耗GTP。
eRF1:真核生物的释放因子,能识别所有三种终止密码子(UAA、UAG、UGA)。因为它没有与GTP结合的位点,所以它不能帮助完成合成多肽从P位点的tRNA的释放。大部分真核生物只含eRF1。
应用[4][5]
用于eRF1的C端结构域在终止密码子识别过程中的功能研究
首先构建了四膜虫(Tetrahymena thermophilia)eRF1的N结构域与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1(Tt/Sc eRF1,Tt/Sp eRF1)。
利用双荧光素酶报告体系检测结果证实,两种杂合的eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显著差异。Tt/Sc eRF1识别终止密码子UGA,而不识别UAA和UAG终止密码子,与四膜虫eRF1一致,表现出了密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是1.98%、3.83%、11.04%);而Tt/Sp eRF1可以识别三个终止密码子,无密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是2.81%、2.01%、1.88%)。
由此说明四膜虫eRF1的N结构域不是决定其识别特异性的唯一因子,在eRF1的M和C结构域中可能存在决定eRF1识别性质的元件或细胞中其它因子可能通过M和C结构域参与eRF1识别终止密码子的过程。为解释这一现象,我们将Sp eRF1的C端小结构域中氨基酸进行突变,选择了其中的第357、361、364和367位的氨基酸突变为酿酒酵母eRF1相应的位点,得到一系列的突变体(Tt/Sp eRF1 A364Q、Tt/Sp eRF1 D361A/A364Q、Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q、Tt/Sp eRF1L357A/D361A/A364Q/E367D)。
同样也将裂殖酵母eRF1的364、367和371位氨基酸引入酿酒酵母eRF1,得到突变体Tt/Sc eRF1 Q364A、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E/E371S。结果显示,所有的突变体对UGA的识别效率没有明显的变化,但是Tt/Sp eRF1的突变体对UAG和UAA的通读效率显著提高,说明其对这两个密码子的识别效率降低。而Tt/Sc eRF1的突变体,对终止密码子识别活性的影响不显著,其对UAG的识别活性稍有提高,通读效率从5.77%降至2.98%,以上结果表明C端小结构域影响到eRF1对UAG和UAA密码子的识别活性。
为了进一步分析小结构域对识别活性的影响,通过对小结构域的蛋白结构分析发现在其结构域中存在关键的、多变的Loop(357~367aa)结构,因此我们将裂殖酵母和四膜虫eRF1小结构域中的Loop结构引入到杂合的Tt/Sc eRF1中。
分析结果显示,引入两种不同Loop结构到Tt/Sc eRF1嵌合体中,均可识别三个终止密码子,说明Loop结构显著的影响终止密码子的识别活性。由此表明,四膜虫eRF1的N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,也说明eRF1的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。
参考文献
[1]PABP enhances release factor recruitment and stop codon recognition during translation termination[J].Alexandr Ivanov,Tatyana Mikhailova,Boris Eliseev,Lahari Yeramala,Elizaveta Sokolova,Denis Susorov,Alexey Shuvalov,Christiane Schaffitzel,Elena Alkalaeva.Nucleic Acids Research.2016(16)
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[3]Cryoelectron Microscopic Structures of Eukaryotic Translation Termination Complexes Containing eRF1-eRF3 or eRF1-ABCE1[J].Anne Preis,Andre Heuer,Clara Barrio-Garcia,Andreas Hauser,Daniel E.Eyler,Otto Berninghausen,Rachel Green,Thomas Becker,Roland Beckmann.Cell Reports.2014(1)
[4]Selectivity of stop codon recognition in translation termination is modulated by multiple conformations of GTS loop in eRF1[J].Leo E.Wong,Yan Li,Shubhadra Pillay,Ludmila Frolova,Konstantin Pervushin.Nucleic Acids Research.2012(12)
[5]闫静.eRF1的C端结构域在终止密码子识别过程中的功能[D].山西大学,2017.