背景[1-3]
猪血管紧张素Ⅱ(ANG-Ⅱ)ELISA KIT用于体液，血清，血浆，细胞培养上清液，尿液，组织匀浆,心房水标本等样本中血管紧张素Ⅱ(ANG-Ⅱ）的含量检测。
猪血管紧张素Ⅱ(ANG-Ⅱ)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被猪血管紧张素Ⅱ(ANG-Ⅱ)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的猪血管紧张素Ⅱ(ANG-Ⅱ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
猪血管紧张素Ⅱ(ANG-Ⅱ)ELISA KIT
操作步骤：
1.使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3.加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5.每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7.每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8.取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9.在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于血管紧张素Ⅱ对肺成纤维细胞纤维化相关信号通路的影响及ACE2-Ang（1-7）-Mas受体轴对其抑制作用的研究
血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是重要的致炎因子,可促进细胞增殖和细胞外基质（ECM）的合成。研究发现MAPK、RhoA-Rock、Smad、NF-κB等信号通路与炎症和组织纤维化密切相关,它们可被各种致炎因子激活,负责调控与炎症和纤维化有关的基因如TGF-β1、Ⅰ型胶原、CTGF、ICAM-1的转录及表达,参与肺成纤维细胞的激活、转化和ECM的合成,对肺纤维化的发生和发展具有重要作用。ACE2-Ang（1-7）-Mas受体轴是新发现的RAAS成分,对ACE-AngⅡ-AT-1R轴有负调控作用,对肺、心、肾的损伤具有保护作用。
Ang（1-7）的重要作用是抑制AngⅡ诱导的炎症损伤和细胞增殖。ACE2-Ang（1-7）-Mas受体轴对于ACE-AngⅡ-AT-1R轴的抑制作用表明,ACE2-Ang（1-7）-Mas受体轴可能是器官纤维化的治疗新靶点。然而目前有关ACE2-Ang（1-7）-Mas受体轴对肺纤维化的影响机制不甚明确,鲜见相关研究报道。本研究为了深入探讨AngⅡ诱导肺纤维化的形成机制以及ACE2-Ang（1-7）-Mas受体轴对肺纤维化的影响,试图从分子和细胞水平分析AngⅡ和Ang（1-7）对肺成纤维细胞中MAPK、RhoA-Rock、Smad、NF-κB信号通路的影响,为肺纤维化的治疗提供新的靶点及依据。
方法：培养人胚肺成纤维细胞（HFL-1）细胞株,分别予AngⅡ0.1μM和Ang（1-7）0.1μM刺激20min,提取总蛋白,western blot方法检测P-ERK1/2、P-P38、P-JNK、ERK1/2、P38、JNK（MAPK通路）、RhoA（RhoA-Rock通路）、Smad3、p-Smad3、Smad4（Smad通路）蛋白表达、免疫荧光方法检测p-Smad3核转位;刺激60min,提取浆蛋白检测IκBα、p-IκKα/β（NF-κB通路）蛋白表达、免疫荧光检查NF-κB核转位、EMSA方法检测NF-κB DNA结合活性;刺激24h,提取蛋白检测CTGF表达、提取RNA检测TGF-β1、α1-Ⅰ型胶原、CTGF、ICAM-1基因表达。AT-1R拮抗剂Irbesartan、P38抑制剂SB203580、ERK抑制剂PD98059、ROCK抑制剂Y27632预处理1小时后再予AngⅡ刺激检测上述指标变化。将Ang（1-7）和AngⅡ同时刺激细胞,观察上述指标,以及Mas受体拮抗剂A779预处理后再予Ang（1-7）和AngⅡ同时刺激,观测上述指标。
参考文献
[1]HMG-CoA Reductase Inhibitors Decrease Angiotensin II–Induced Vascular Fibrosis:Role of RhoA/ROCK and MAPK Pathways[J].Mónica Rupérez,Raquel Rodrigues-Díez,Luis Miguel Blanco-Colio,Elsa Sánchez-López,Juan Rodríguez-Vita,Vanesa Esteban,Gisselle Carvajal,Juan JoséPlaza,Jesús Egido,Marta Ruiz-Ortega.Hypertension.2007(2)
[2]Essential Role of Smad3 in Angiotensin II–Induced Vascular Fibrosis[J].Wansheng Wang,Xiao R.Huang,Ellery Canlas,Kazuhiro Oka,Luan D.Truong,Chuxia Deng,Neil A.Bhowmick,Wenjun Ju,Erwin P.Bottinger,Hui Y.Lan.Circulation Research.2006(8)
[3]Effect of Long-Term Inhalation of Toner on Extracellular Matrix in the Lungs of Rats In Vivo[J].Dr.Yasuo Marimoto,Heungnam Kim,Takako Oyabu,Masami Hirohashi,Hiroko Nagatomo,Akira Ogami,Hiroshi Yamato,Toshiaki Higashi,Isamu Tanaka,Takahiko Kasai.Inhalation Toxicology.2005(3)
[4]Angiotensin II Activates the Smad Pathway in Vascular Smooth Muscle Cells by a Transforming Growth Factor-β–Independent Mechanism[J].Juan Rodríguez-Vita,Elsa Sánchez-López,Vanesa Esteban,Mónica Rupérez,Jesús Egido,Marta Ruiz-Ortega.Circulation.2005(19)
[5]孟莹.血管紧张素Ⅱ对肺成纤维细胞纤维化相关信号通路的影响及ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴对其抑制作用的研究[D].南方医科大学,2009.