背景[1-3]
人DNA甲基化转移酶2(DNMT2)ELISA试剂盒运用双抗体夹心ELISA酶联免疫法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体样本中PCDH1含量。
实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人DNA甲基化转移酶(DNMT)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人DNA甲基化转移酶(DNMT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
人DNA甲基化转移酶2(DNMT2)ELISA试剂盒
样本制备及注意事项:
1.细胞培养上清:2000-3000转/分离心20分钟后取上清;
2.组织匀浆:切割标本后,称重,按1:生理盐水匀浆,5000转/分离心3-5分钟后取上清;
3.血清:样本室温放置2小时或4℃过夜后取上清;
4.血浆:可用EDTA、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂(根据试剂盒要求选择),样本加入10%抗凝剂混合10-20分钟,2000-3000转/分离心20分钟后取上清;
5.尿液、胸水、腹水、脑积液等:2000-3000转/分离心20分钟后取上清。
操作步骤:
1.标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。
2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7.温育:操作同3。
8.洗涤:操作同5。
9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟.
10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
应用[4][5]
用于甲壳动物DNA甲基转移酶2(Dnmt2)基因的分子特征、表达分析及DNA甲基化水平检测研究
以甲壳动物卤虫Artemia franciscana和罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii为研究对象,通过对Dnmt2基因的表达分析以及DNA甲基化水平的测定,阐明了Dnmt2基因的表达变化与卤虫和罗氏沼虾的胚胎发育有着密切的关系,但与DNA甲基化水平没有明显的相关性。
本研究为Dnmt2基因在甲壳动物中功能的研究奠定了基础,其结果主要包括以下三个方面:1.采用CODEHOP兼并引物方法,在甲壳动物卤虫和罗氏沼虾中分离得到Dnmt2基因,并各自命名为AfDnmt2和MarDnmt2。我们获得的AfDnmt2 cDNA长度为1054-bp,包含了一个1140-bp长度的开放式阅读框(open reading frame,ORF)。此开放式阅读框编码379个氨基酸残基;MarDnmt2 cDNA全长为1472-bp,包含一个1191-bp长度的开放式阅读框,此开放式阅读框编码编码396个氨基酸残基。AfDnmt2和MarDnmt2各自编码的蛋白质与其它种类Dnmt2相比,均呈现出30%—40%的相似性、十个DNA甲基转移酶特征性的模体,以及一个目标识别域(target recognized domain,TRD)。这是首次在甲壳动物中报道Dnmt2基因,也是现今已知的唯一的甲壳动物Dnmt基因。并且,采用PCR和Southern Blotting方法,对AfDnmt2在基因组上的结构进行分析,结果表明,AfDnmt2在基因组上不存在内含子,并且以多拷贝形式存在于卤虫基因组中。
2.采用半定量RT-PCR分析方法,检测AfDnmt2在卤虫休眠卵发育过程中的表达。结果显示,在卤虫休眠囊胚的孵化过程中,AfDnmt2 mRNA水平表现出明显的上升趋势,当休眠囊胚孵化10小时时,AfDnmt2 mRNA水平达到最高。接着,伴随着卤虫无节幼体的出现,AfDnmt2水平呈现明显的下降;对幼虫和成虫的AfDnmt2表达水平检测中发现,幼虫L7时期到幼虫L12时期,AfDnmt2 mRNA有一明显的下降过程。成熟的雌性卤虫与雄性卤虫之间,AfDnmt2 mRNA水平未出现较大的差异。采用C~5-甲基胞嘧啶抗体检测方法,对卤虫的基因组DNA甲基化水平进行测定。结果发现,卤虫DNA甲基化水平约为0.02%,AfDnmt2基因的表达变化与DNA甲基化水平没有明显的相关性。
3.采用荧光定量PCR的方法,对罗氏沼虾MarDnmt2进行表达特征研究,结果表明,MarDnmt2在罗氏沼虾的各个组织中均能检测到其表达,但是,卵巢组织中的MarDnmt2 mRNA水平最高,约是其它组织的5-16倍,呈现出组织特异性的表达方式。进一步对罗氏沼虾的胚胎发育过程研究发现,MarDnmt2 mRNA水平与罗氏沼虾胚胎发育有着密切的关系。即随着卵巢的发育,MarDnmt2 mRNA水平逐步上升,到卵巢最成熟时期,其表达量达到最高。
参考文献
[1]Regularized logistic regression with adjusted adaptive elastic net for gene selection in high dimensional cancer classification[J].Zakariya Yahya Algamal,Muhammad Hisyam Lee.Computers in Biology and Medicine.2015
[2]Dnmt3a and Dnmt3b Have Overlapping and Distinct Functions in Hematopoietic Stem Cells[J].Grant A.Challen,Deqiang Sun,Allison Mayle,Mira Jeong,Min Luo,Benjamin Rodriguez,Cates Mallaney,Hamza Celik,Liubin Yang,Zheng Xia,Sean Cullen,Jonathan Berg,Yayun Zheng,Gretchen J.Darlington,Wei Li,Margaret A.Goodell.Cell Stem Cell.2014(3)
[3]Investigation of the expression patterns and correlation of DNA methyltransferasesand class I histone deacetylases in ovarian cancer tissues[J].Yifeng Gu,Peifang Yang,Qing Shao,Xia Liu,Sheng Xia,Miaomiao Zhang,Huaxi Xu,Qixiang Shao.Oncology Letters.2013(2)
[4]DNA Demethylation and USF Regulate the Meiosis-Specific Expression of the Mouse Miwi[J].Yu Hou,Jia Yuan,Xiang Zhou,Xiazhou Fu,Hanhua Cheng,Rongjia Zhou.PLOS Genetics.2012(5)
[5]冯琛卓.甲壳动物DNA甲基转移酶2(Dnmt2)基因的分子特征、表达分析及DNA甲基化水平检测[D].浙江大学,2007.