背景[1-3]
人免疫核糖核酸(IRNA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中免疫核糖核酸(IRNA)的含量。
实验原理:
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被免疫核糖核酸(IRNA)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的免疫核糖核酸(IRNA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人免疫核糖核酸(IRNA)ELISA试剂盒
标本的采集及保存
一、样本要求：液态类标本（细胞培养上清、组织匀浆、血清、血浆、尿液、胸水、腹水、脑积液等）
1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
操作步骤：
1.使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3.加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
4.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5.每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7.每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。
8.取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9.在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于抗肝癌免疫核糖核酸整体扩增技术的建立及抗肝癌作用研究
针对AT-iRNA中活性mRNA含量较少,从而影响治疗效果的问题出发,结合mRNA体外整体扩增技术,参照RNA疫苗制备研究中mRNA整体扩增流程,建立针对AT-iRNA中mRNA大量扩增的技术,并通过体内外实验验证了扩增的mRNA具有的抗肿瘤活性。
应用组织酶消化与差速离心法从肝癌组织分离纯化肝癌细胞,通过超声获取肝癌细胞与肝癌组织蛋白。将上述两组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过ELISA测定小鼠血浆抗肿瘤抗原的免疫效价,Trizol提取小鼠脾脏的总RNA,应用凝胶电泳与紫外测定提取RNA的完整性与含量。
实验结果显示:（1）分离纯化的肝癌细胞蛋白抗原免疫的动物获得血清抗肿瘤效价与明显优于肝癌组织直接提取蛋白抗原,（2）肝癌细胞蛋白免疫动物的脾细胞抗肝癌的活性高于肝癌组织直接提取蛋白抗原组。（3）提取的RNA电泳显示了提取RNA具有完整性,提取的RNA含量在150μg/只脾左右,OD260/OD280在1.8-2.0之间。
2. 成功建立了免疫活性RNA（mRNA）体外整体扩增的技术免疫小鼠获取的脾细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA,在逆转录过程中,（1）设计12种与mRNA POLY（A）结合的寡核苷酸序列,保证总RNA中所有的具有POLY（A）mRNA得以逆转录,并包含一段公用引物,用于下一步cDNA扩增（2）寡核苷酸Cap,包含T7RNA聚合酶的启动子序列与转换序列GGG。针对逆转录获得cDNA,应用通用引物及长片段扩增PCR反应试剂进行所有cDNA同步扩增,扩增后的DNA应用电泳进行观察,紫外检测DNA含量。以扩增的cDNA为模板,应用T7体外RNA转录反应体系进行整体RNA的转录,转录的RNA通过紫外检测含量。选择GAPDH、Actin、IFG-γ等基因,根据基因序列分别设计目的片段长度为179 bp、987 bp、1424 bp的引物,分别以等体积的抗肿瘤iRNA和经过整体扩增的AT-iRNA为模板,经过逆转录后分别进行实时荧光定量PCR检测,产物进行凝胶电泳。通过观察Ct值以及电泳条带的亮度、位置,判断整体扩增的mRNA的完整性。通过RNA含量计算mRNA扩增效果。
实验结果显示（1）4ng逆转录cDNA经过体外扩增,扩增产物纯化后的电泳显示不同长度片段扩增产物产生,含量测定为2.5μg,扩增效率为625倍。（2）在体外转录的模板是cDNA100ng,最终最多扩增的数量是13μg,扩增100多倍。（3）分别以等体积的抗肿瘤iRNA和经过整体扩增的AT-iRNA为模板,经过逆转录后通过实时荧光定量PCR法检测GAPDH等内参基因以及IFN-γ等的基因的表达。通过Ct值应用相对定量法计算这些基因经过整体扩增后的扩增倍数。结果表明与原始iRNA相比,扩增后的AT-iRNA中GAPDH、IFN-γ等基因得到有效扩增,倍率200倍~1200倍不等,不仅说明了体外扩增工艺的保真性,而且基因mRNA绝对含量显著增加。
3.体内外实验证实新型抗肿瘤核糖核酸具有显著的抗肿瘤生物学作用在体外研究中分离获取人外周血单个核细胞,分别将扩增的核糖核酸与未扩增的RNA作用于外周血单个核细胞,将刺激的细胞作用于人肝癌细胞株,通过CCK-8检测细胞的活性,应用ELISA方法检测免疫细胞上清的IFN-γ的含量。制备小鼠肝癌细胞荷瘤动物模型,分别给予商品化的抗肝癌免疫RNA、扩增的核糖核酸（低剂量与高剂量）,通过观察肿瘤细胞重量与体积判断肿瘤生长的抑制情况,HE染色观察肿瘤组织细胞活性情况,流式细胞术检测淋巴细胞表型变化,实时定量PCR检测肿瘤凋亡相关基因表达与免疫细胞相关细胞因子的表达。
参考文献
[1]Pronase independent flow cytometry crossmatching of rituximab treated patients[J].Mats Alheim,Lars Wennberg,Ann-Charlotte Wikstr?m.Human Immunology.2018(2)
[2]MicroRNA-140 suppresses osteosarcoma tumor growth by enhancing anti-tumor immune response and blocking mTOR signaling[J].Xianglu Ji,Enbo Wang,Feng Tian.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2018(1)
[3]Tolerance development in Listeria monocytogenes-Escherichia coli dual-species biofilms after sublethal exposures to pronase-benzalkonium chloride combined treatments[J].Pedro Rodríguez-López,Marta López Cabo.Food Microbiology.2017
[4]Mechanism of action of mRNA-based vaccines[J].Iavarone,O’hagan,Yu,Delahaye,Ulmer.Expert Review of Vaccines.2017(9)
[5]赵冠杰.抗肝癌免疫核糖核酸整体扩增技术的建立及抗肝癌作用研究[D].吉林大学,2019.