背景[1-3]
人电子转移黄素蛋白Β肽(ETFB)ELISA试剂盒用于体外定量测定人血清或血浆中电子转移黄素蛋白Β肽(ETFB)的含量。
实验原理:电子转移黄素蛋白Β肽(ETFB)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被电子转移黄素蛋白Β肽(ETFB)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的电子转移黄素蛋白Β肽(ETFB)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
人电子转移黄素蛋白Β肽(ETFB)ELISA试剂盒
样本处理要求
1.血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
2.血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
3.尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。
应用[4][5]
用于脂质沉积性肌病临床、病理与基因研究
研究发现我国的LSM绝大多数为核黄素反应性的MADD(RR-MADD),并且电子转移黄素蛋白脱氢酶(electron tranfer flavoprotein dehydrogenase,ETFDH)缺陷是其主要分子病理基础。这使得对LSM的临床、病理、基因特点的认识尤为重要。多种酯酰辅酶A脱氢酶缺乏症是一种常染色体隐性遗传性疾病。其临床表现多样,分为三个亚型,Ⅰ型为新生儿期发病,同时存在先天异常;Ⅱ型同样为新生儿期起病,但不伴有先天异常;Ⅲ型也称为迟发型,症状多样,相对较轻。MADD多是由于电子转移黄素蛋白(electron transfer flavoprotein,ETF)α或β亚组或电子转移黄素蛋白-泛醌氧化还原酶(electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase,ETF-QO)的缺陷而导致的,编码基因分别是ETFA、ETFB、ETFDH。
对103例多种酯酰辅酶A脱氢酶缺乏症(MADD)基因型与表现型汇总分析目的:汇总分析多种酯酰辅酶A脱氢酶缺乏症(MADD)基因型与表现型关联性。
方法:计算机检索Pub Med医学文献检索服务系统中关于MADD及其基因突变的相关文献,选择符合研究目的及纳入和排除标准的文献,汇总纳入文献中的病例基因突变和临床资料。计量资料不符合正态分布,采用中位数及四分位数间距M(QR)表示,用Mann-Whitney秩和检验和Kruskal-Wallis秩和检验进行不同基因突变间发病年龄差异性分析。
比较不同突变位点出现某一临床症状的比率有无差别时采用连续性校正的卡方检验,用相对危险度(odds ratio,OR)评价某种突变与症状间关联强度。结果:共纳入16篇文献,汇总103例MADD病例。
ETFA、ETFB、ETFDH三种基因发病年龄差异有统计学意义,ETFDH基因突变较ETF基因发病年龄大。总结ETFA、ETFB、ETFDH基因突变数分别为23、11、68个,发现6个高频突变位点ETFA c.797C>T,ETFDH c.389A>T,c.250G>A,c.770A>G,c.1227A>C,c.1367C>T。
各高频位点与其他位点间发病年龄无显著差异。ETFDH c.250G>A突变是颈肌无力的危险因素;c.770A>G突变是颈肌无力、咀嚼肌无力的危险因素;c.1227A>C突变是肌痛的危险因素;c.1367C>T突变是颈肌无力的保护因素。
参考文献
[1]A case of late-onset riboflavin responsive multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency(MADD)with a novel mutation in ETFDH gene[J].Zhihong Zhuo,Peina Jin,Fengyan Li,Haiying Li,Xiaoxin Chen,Huaili Wang.Journal of the Neurological Sciences.2015(1-2)
[2]Clinical features and ETFDH mutation spectrum in a cohort of 90 Chinese patients with late-onset multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency[J].Jianying Xi,Bing Wen,Jie Lin,Wenhua Zhu,Sushan Luo,Chongbo Zhao,Duoling Li,Pengfei Lin,Jiahong Lu,Chuanzhu Yan.Journal of Inherited Metabolic Disease.2014(3)
[3]Increased muscle coenzyme Q10 in riboflavin responsive MADD with ETFDH gene mutations due to secondary mitochondrial proliferation[J].Bing Wen,Duoling Li,Jingli Shan,Shuping Liu,Wei Li,Yuying Zhao,Pengfei Lin,Jinfan Zheng,Danian Li,Yaoqin Gong,Chuanzhu Yan.Molecular Genetics and Metabolism.2013(2)
[4]Riboflavin-responsive multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency with unknown genetic defect[J].Maria Sofia Cotelli,Valentina Vielmi,Marco Rimoldi,Manuela Rizzetto,Barbara Castellotti,Valeria Bertasi,Alice Todeschini,Valeria Gregorelli,Carla Baronchelli,Cinzia Gellera,Alessandro Padovani,Massimiliano Filosto.Neurological Sciences.2012(6)
[5]戚莉君.脂质沉积性肌病临床、病理与基因研究[D].山西医科大学,2016.