背景[1-3]
HT-29人结直肠腺癌细胞是1964年由福格用外植体培养法从原发肿瘤中分离出来的。HT-29细胞表达尿激酶受体，但未检测到纤溶酶原物活性[PubMed ID:8381394]。HT-29细胞CD4表达阴性，但细胞表面表达半乳糖神经酰胺（一个HIV的可替代受体）。致癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、Myb、sis、fos表达阳性，过量产生p53抗原，在p53基因的273密码子处有G->A突变导致Arg->His替换，未检测到致癌基因N-myc的表达。
HT-29人结直肠腺癌细胞
细胞接收后的处理方法
1）收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染。
2）在显微镜下确认细胞生长状态时，在低倍镜（4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下，同时给细胞拍照各2-3张（10×，20×都要拍照），作为售后的依据。
3）观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。
细胞培养步骤
1、培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM培养基；马血清，10%；双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
2、细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于抗EGFR单克隆抗体联合COX-2抑制剂对人结直肠腺癌HT-29细胞的放射增敏研究
通过体外研究比较单独应用西妥昔单抗、塞来昔布与两者联合应用放射线后,对人结直肠癌HT-29细胞株增殖、凋亡及细胞周期分布的影响及HT-29细胞中Caspase-3的蛋白表达水平的变化,为结直肠肿瘤放疗增敏药物的临床应用提供实验基础。
方法：1.MTT法检测西妥昔单抗与塞来昔布及两药联用对人结直肠腺癌HT-29细胞株增殖的抑制率；
2. 平板克隆形成实验检测西妥昔单抗与塞来昔布两药联用对人结直肠腺癌HT-29细胞株放射敏感性的影响；
3. 流式细胞技术检测西妥昔单抗与塞来昔布两药联用对人结直肠腺癌HT-29细胞株的细胞周期及凋亡率影响；
4. 蛋白免疫印迹法检测人结直肠腺癌HT-29细胞株经过西妥昔单抗与塞来昔布联合放射线后Caspase-3表达量的变化。
实验结果:1.MTT实验结果显示：将西妥昔单抗药物浓度分为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml及空白对照组,分别作用于人结直肠腺癌HT-29细胞株24h后,细胞增殖抑制率分别为：3.57%,20.11%,32.99%,47.36%,53.75%,68.79%，83.92%,MTT法测得西妥昔单抗作用于HT-29细胞24h后的IC50浓度为281μg/ml；将塞来昔布药物浓度分为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml、3200μg/ml、6400μg/ml及空白对照组,应用同样的方法测得塞来昔布作用于HT-29细胞24h后的IC50浓度为2720μg/ml;将西妥昔单抗与塞来昔布按照1：2、1：1、2：1的比例进行配比,作用于HT-29细胞24h后,其IC50值分别为：632μg/ml、351μg/ml、193μg/ml。且两药联用组的细胞生长抑制率明显高于单纯用药组,具有统计学意义（P＜0.05）。
2. 克隆形成实验结果显示：两药联用25μg/ml及50μg/ml附加照射组的DO值（平均致死剂量）、Dq值（细胞损伤的准域剂量）、N值（放射损伤修复能力）、SF2（照射2Gy后的细胞存活分数）分别为：2.505、2.804、3.064、0.826及2.184、2.370、2.960、0.772,均小于单纯照射组的3.368、3.993、3.273、0.922,并且药物浓度越大,其数值越小。联合应用西妥昔单抗与塞来昔布后,HT-29细胞的放射敏感性增强,SER（Do）分别为：1.345、1.542；SER（Dq）分别为：1.424、1.685。说明西妥昔单抗与塞来昔布联用能有效减弱HT-29细胞株的放射抗拒性及亚致死性损伤修复的能力,增强其放射敏感性。
3. 流式细胞术实验结果显示：单纯用药组对应于药物浓度（25μg/ml、50μg/ml）诱导HT-29细胞株凋亡率分别为：7.21%、11.74%；单纯照射组的凋亡率对应于照射剂量（2Gy、4Gy、6Gy、8Gy）分别为：10.93%、16.45%、29.84%、39.57%;25μg/ml药物联合附加照射组的凋亡率分别为：17.89%、25.02%、40.32%、48.33%;50μg/ml药物联合附加照射组的凋亡率分别为：22.06%、34.39%、47.57%、54.03%。单纯用药组及低剂量照射组出现了G0/G1期的阻滞现象,而且与用药浓度成正比,具有统计学意义（P＜0.05）。当照射剂量为6、8Gy时,S期细胞减少情况明显,具有统计学意义（P＜0.05）；在联用药物50μg/ml附加照射8Gy组中,S期达到了最低值11.78%。当照射剂量为4、6、8Gy时G2/M期阻滞明显,具有统计学意义（P＜0.05）；在联用药物50μg/ml附加照射8Gy组中,G2/M期达到了最高值27.63%。
4.Western Blot法检测结果显示：单纯照射组、联用药物附加照射组Caspase-3的蛋白表达量均高于空白对照组,具有统计学意义（P＜0.05）；联用药物附加照射组的表达量高于单纯照射组,具有统计学意义（P＜0.05）；高浓度药物组的表达量与低浓度组有明显差异,药物浓度与表达量成正比,具有统计学意义（P＜0.05）。
参考文献
[1]Radiation Therapy in Anal and Rectal Cancer[J].Brian G.Czito,Jeffrey Meyer.Surgical Oncology Clinics of North America.2013(3)
[2]Phase 2 study of preoperative radiation with concurrent capecitabine,oxaliplatin,and bevacizumab followed by surgery and postoperative 5‐fluorouracil,leucovorin,oxaliplatin（FOLFOX）,and bevacizumab in patients with locally advanced rectal cancer:ECOG 3204[J].Jerome C.Landry,Yang Feng,Steven J.Cohen,Charles A.Staley,Richard Whittington,Elin Ruth Sigurdson,Halla Nimeiri,Udit Verma,Roshan S.Prabhu,Al Bowen Benson.Cancer.2013(8)
[3]Three cytotoxic drugs combined with pelvic radiation and as maintenance chemotherapy for patients with squamous cell carcinoma of the anus（SCCA）:Long-term follow-up of a phase II pilot study using 5-fluorouracil,mitomycin C and cisplatin[J].David Sebag-Montefiore,Helen M.Meadows,David Cunningham,Piers N.Plowman,David C.Hurman,Neville Davidson,Robert Grieve,Ed Levine,Rob Glynne-Jones.Radiotherapy and Oncology.2012(2)
[4]RTOG 0529:A Phase 2 Evaluation of Dose-Painted Intensity Modulated Radiation Therapy in Combination With 5-Fluorouracil and Mitomycin-C for the Reduction of Acute Morbidity in Carcinoma of the Anal Canal[J].Lisa A.Kachnic,Kathryn Winter,Robert J.Myerson,Michael D.Goodyear,John Willins,Jacqueline Esthappan,Michael G.Haddock,Marvin Rotman,Parag J.Parikh,Howard Safran,Christopher G.Willett.International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics.2012
[5]姜文翰.抗EGFR单克隆抗体联合COX-2抑制剂对人结直肠腺癌HT-29细胞的放射增敏研究[D].郑州大学,2014.