背景[1-3]
人ΑN已酰氨基葡糖苷酶(ΑNAG)ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中ΑN已酰氨基葡糖苷酶(ΑNAG)的含量。
实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被ΑN已酰氨基葡糖苷酶(ΑNAG)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ΑN已酰氨基葡糖苷酶(ΑNAG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人ΑN已酰氨基葡糖苷酶(ΑNAG)ELISA试剂盒
样本处理及要求
1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于家蚕核型多角体病毒与家蚕抗病毒相关的蛋白质组分析研究
从蛋白质组水平研究杆状病毒的ODV病毒粒子结构组分。通过构建近等基因系研究宿主对抗病毒感染的相关蛋白,希望筛选出一些与家蚕抗性或者感性相关的节点蛋白。同时也从DNA水平筛选抗性相关的分子标记。
此外,论文中对构建的近等基因系从不同角度进行了评估,对利用家蚕EST数据库鉴定质谱结果也进行了分析。
主要结果如下:通过蔗糖密度梯度离心得到了家蚕核型多角体的ODV病毒粒子,并首次使用SDS-PAGE,二维电泳和质谱技术鉴定了ODV病毒粒子或与之相关的蛋白。鉴定了可靠的19种蛋白,包括15种BmNPV编码的病毒粒子主要蛋白,分别是Polyhedrin,P78/83,BmOrf 40,BmOrf 54,GP41/P40,P95,VP39,P25,ODV-EC43,BmOrf 94,BmOrf 109,P74,P49,ODV-E56和PTP,和4种家蚕蛋白,热休克同源蛋白,Hsp21.4,谷胱甘肽硫转移酶,肽基脯氨酰异构酶。
其中2种BmNPV的蛋白BmOrf40和PTP,为首次鉴定为ODV组成。并且我们提出一种假说,本研究鉴定的家蚕宿主来源的蛋白可能对ODV核衣壳包装和成熟有着重要的作用。在抗核型多角体病毒（NPV）病的家蚕品种NB和高敏感品种306及其近等基因系BC9中,采用500个RAPD随机引物分别在各个品系的DNA混合物进行扩增以筛选分子标记,获得了与家蚕抗NPV病有关的分子标记三个OPF-072023,OPJ-131300,OPM-161200。
其中OPF-072023标记通过回交代检测,证明获得的标记真实、可靠,并对该分子标记的片段进行了克隆、测序。通过对该片段的生物信息学分析,推测在此分子标记处可能有DNA片段的插入,还在家蚕Z染色体上发现了一个逆转位子的编码序列。另外还介绍了一种PCR单一产物直接染色判断有或无的定性检测方法。
为了利于研究NB品系家蚕这种突出的抗病毒特性相关的蛋白,对高抗,高敏感及近等基因系家蚕五龄起蚕中肠、血淋巴和脂肪体组织的蛋白质表达进行了二维电泳分析,并利用质谱对差异蛋白进行鉴定。
对3个家蚕品系的差异蛋白表达进行了比较。在中肠中鉴定了5个差异蛋白,其中1和2在抗性品系NB和BC9表达量高于306,而3,4,5号这3种蛋白在306中表达较高,这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。在血淋巴中,有两种差异表达的蛋白,分别是β-N已酰氨基葡糖苷酶2和氨基酰化酶,我们推测在抗性家蚕的血淋巴中过量表达的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可能会干扰细胞膜上的GP64蛋白的N连接聚糖,从而阻止了启动二次感染的一个关键蛋白的功能,进而减少了产生有感染力病毒粒子。
在脂肪体组织中鉴定了4种蛋白,其中2种可能与能量代谢有关,其中1号蛋白与磷酸甘油激酶（PGK）在序列上高度相似,2号蛋白是家蚕精氨酸激酶（AK）。第4号蛋白可能和整合酶的功能相似,第3号蛋白未能鉴定。为了从分子水平上评估我们构建的近等基因系的可靠性,尤其是对其与感性的轮回亲本之间遗传背景的相似性进行了评估。
参考文献
[1]AcMNPV ac143（odv-e18）is essential for mediating budded virus production and is the 30th baculovirus core gene[J].Christina B.McCarthy,David A.Theilmann.Virology.2008(1)
[2]Extended budded virus formation and induction of apoptosis by an AcMNPV FP-25/p35 double mutant in Trichoplusia ni cells[J].Barbara J.Kelly,Susan D.J.Chapple,Clare Allen,Carolyn Pritchard,Linda A.King,Robert D.Possee.Virus Research.2008(2)
[3]Development of a heat shock inducible and inheritable RNAi system in silkworm[J].Hongjiu Dai,Rongjing Jiang,Jue Wang,Guojiang Xu,Meixun Cao,Zhugang Wang,Jian Fei.Biomolecular Engineering.2007(6)
[4]Studies on middle and posterior silk glands of silkworm（Bombyx mori）using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry[J].Yong Hou,Qingyou Xia,Ping Zhao,Yong Zou,Hongli Liu,Jian Guan,Jing Gong,Zhonghuai Xiang.Insect Biochemistry and Molecular Biology.2007(5)
[5]刘晓勇.家蚕核型多角体病毒与家蚕抗病毒相关的蛋白质组分析[D].江苏大学,2009.