背景[1-3]
小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)的含量。
检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)抗体包被于酶标板上,实验时样品(或标准品)中的小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)会与包被抗体结合,游离的成分被洗去,然后依次加入生物素化的抗小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)抗体,HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值,小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)浓度与OD450值之间呈正比,通过绘制标准曲线计算出样品中小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)的浓度。
小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)ELISA KIT
样品收集:
1.血清:全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟,取上清即可检测,收集血液的试管应为一次性的无热原,无内毒素试管。
2.血浆:抗凝剂推荐使用EDTA-Na2,样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟,取上清即可检测。避免使用溶血,高血脂样品。
3.组织匀浆:用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。
4.细胞培养上清:取细胞培养上清于1000×g离心20分钟,除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
操作步骤:
1.使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。
2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。
3.加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育45分钟。
4.甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
5.每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。
6.甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
7.每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育5分钟。避免光照。
8.取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。
9.在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断与分析:
1、仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的指标标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线,样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
应用[4][5]
用于小鼠胚胎干细胞培养及神经分化的研究
1.剪刀切割结合针头挤压小鼠胎儿组织能有效获得均匀、大小适中并容易贴壁生长的小组织块。将这些组织块培养48h,大量的梭形细胞从贴壁小组织块的边缘游离出的,细胞密度大,细胞生长旺盛,很快形成原代小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)单层。MEF用5μg/ml的丝裂霉素处理2.5-4h,10μg/ml的丝裂霉素处理1-4h或20μg/ml的丝裂霉素处理1-2.5h均可有效抑制其分裂,并保持细胞的正常活力;用14、21、28GRAY的γ射线处理,亦可有效抑制MEF的分裂,保持细胞的正常活力。
2.小鼠ES细胞解冻后,在饲养层培养体系用含LIF(1000U/ml)的完全培养液培养48h时,ES细胞形成边界清晰光滑的克隆,克隆内细胞排列紧密,难以辩认单个细胞,克隆边缘未见分化细胞;此时Oct-4细胞表达强烈的Oct-4-GFP绿色荧光,RT-PCR检测到细胞有高水平的Oct-4 mRNA,碱性磷酸酶AKP反应结果呈强阳性,表明细胞处于良好的未分化形态。如果在无饲养层培养体系培养48h,ES细胞出现了不同分化程度的克隆形态,表明饲养层能较好地控制ES细胞复苏时分化的发生。
3.将在饲养层培养体系中已培养2-3代的ES细胞接种于有饲养层及预铺了0.1%明胶(无饲养层)的96孔板中培养,在培养液中添加1000,1500,2000IU/ml的LIF能显著提高ES细胞的阳性度(有饲养层培养:17.80±3.26,19.58±3.19,21.8±3.17 vs 2.69±0.26;无饲养层培养:14.14±2.35,17.87±2.38,19.21±2.92 vs 0.016±0.0005,p<0.01)及克隆形成率(有饲养层培养:29.1%,31.8%,33.5%vs 6.5%:无饲养层培养:24.7%,27.8%,31.2%vs 0.8%,p<0.01);但不同浓度LIF之间的阳性度及克隆形成率差异不显著(p>0.05)。当不添加LIF时,饲养层培养法能显著地地提高ES细胞的AKP阳性度及克隆形成率(2.69±0.26 vs 0.016±0.0005;6.5%vs 0.8%,p<0.01)。说明饲养层细胞在ES细胞的分化抑制中有一定作用,而起主导作用的是外源LIF。
4.培养液种类及添加谷氨酰胺、丙酮酸钠和非必需氨基酸对ES细胞体外培养的效果影响较小,而培养用水和血清品质对ES细胞体外培养的效果影响较大。Milli-Q水经亚沸处理能显著提高ES细胞保持未分化状态的能力,优质胎牛血清能提高ES的AKP阳性度和克隆形成率。
参考文献
[1]Leukaemia inhibitory factor is identical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells.Moreau J F,Donaldson D D,Bennett F,et al.Nature.1988
[2]A strain-independent postnatal neurodegeneration in mice lacking the EGF receptor.Sibilia M,Steinbach JP,Stingl L,et al.EMBO Journal.1998
[3]CNS stem cells:where’s the biology(a.k.a.beef).Weiss S,van der Kooy D.Journal of Neurobiology.1998
[4]An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.Wharton KA,Ray RP and Gelbart WM.Development.1993
[5]蒙超衡.小鼠胚胎干细胞培养及神经分化的研究[D].广西大学,2004.