背景[1-3]
人胆管癌细胞分离自人胆管癌的原代细胞系，可以用于胆管癌的体外细胞学研究。胆管细胞癌是长在肝脏里的，肝脏有两种细胞，一种是肝细胞，一种是胆管细胞。如果长在胆管细胞上的癌症就是胆管细胞癌，就是胆管细胞恶变形成的癌。
人胆管癌细胞
人胆管癌细胞培养操作规程
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO，货号11965-092)，90%；北美胎牛血清，10%。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。
3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。
4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。
应用[4][5]
人胆管癌细胞可以用于龙葵提取物澳洲茄边碱对人胆管癌细胞生长及转移的影响
探讨龙葵提取物澳洲茄边碱对人胆管癌细胞的促进凋亡、抑制增殖和转移作用及其机制。
方法:①采用0,2,4,6,8,10 μM浓度的澳洲茄边碱处理对数生长期人胆管癌细胞系QBC939细胞株后,用倒置光学显微镜观察细胞数目、细胞形态的变化;MTT法检测细胞增殖抑制率,选择药物作用时间及药物浓度,探讨澳洲茄边碱对人胆管癌QBC939细胞增殖的影响;
②采用上述浓度的澳洲茄边碱处理对数生长期人胆管癌细胞系QBC939后,采用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率及凋亡分布情况,观察澳洲茄边碱对人胆管癌QBC939细胞凋亡的影响;
③采用上述浓度的澳洲茄边碱处理对数生长期人胆管癌细胞系QBC939后,在JC-1染色细胞后用流式细胞术检测肿瘤细胞线粒体膜电位的变化情况;用Q-PCR检测8Bcl-2、Bcl-XL、Bax和XIAP凋亡基因的表达情况;用Western blot方法检测凋亡蛋白Bcl-2与Bax、Caspase-3、XIAP、RARP等蛋白的变化情况,探讨澳洲茄边碱诱导胆管癌QBC939细胞凋亡的作用机制;
④采用上述浓度的澳洲茄边碱处理对数生长期人胆管癌细胞系QBC939后,划痕试验、Transwell检测细胞迁移及侵袭能力变化情况;Q-PCR及 Western blot 检测 EMT 相关蛋白 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 及 Snail 的 mRNA 及蛋白的表达变化,Western blot检测PI3K/AKT信号通路的表达变化,探讨澳洲茄边碱对人胆管癌QBC939细胞转移的影响及作用机制。
结果:①细胞实验结果表明,澳洲茄边碱作用人胆管癌QBC939细胞后,细胞形态学观察,出现了细胞核皱缩,细胞形态不规则改变及出现凋亡小体等细胞凋亡的表现。MTT检测提示澳洲茄边碱对人胆管癌QBC939细胞具有明显的浓度依赖性抑制增殖作用,且其半抑制浓度(IC50)值为9.81μM;
②流式细胞术AnnexinV-FITC和PI标记法对细胞凋亡比例的测定结果显示,澳洲茄边碱可促进人胆管癌QBC939细胞的凋亡,并呈明显的浓度依赖(尤其是浓度>6μM),细胞早晚期凋亡率均升高,以早期凋亡为主;
③用JC-1染色肿瘤细胞后,流式细胞术检测显示肿瘤细胞线粒体膜电位降低。应用Western blot实验显示抑制凋亡的代表基因Bcl-2表达下调,凋亡抑制蛋白XIAP和DNA损伤修复酶PARP表达下调,而Caspase3及Caspase7表达上调,说明细胞处于凋亡状态,而Bax促凋亡基因编码的Bax蛋白增加进一步说明细胞进入凋亡状态;
④划痕及Transwell试验检测提示澳洲茄边碱可抑制人胆管癌QBC939细胞迁移及侵袭,进一步检测其机制提示澳洲茄边碱可抑制PI3K/AKT信号通路表达,下调转录因子Snail,促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin和Vimentin的表达。
结论:①龙葵提取物澳洲茄边碱可以抑制人胆管癌QBC939细胞增殖,并通过降低肿瘤细胞线粒体膜电位、上调促凋亡蛋白的表达并下调抑凋亡蛋白的表达诱导肿瘤细胞凋亡;
②龙葵提取物澳洲茄边碱可抑制人胆管癌QBC939细胞迁移及侵袭,其机制可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路表达,下调转录因子Snail,促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin和Vimentin,从而阻断EMT过程来抑制胆管癌细胞转移和侵袭。
③澳洲茄边碱能够抑制人胆管癌QBC939细胞生长及转移,提示龙葵提取物澳洲茄边碱可能是胆管癌治疗的有效药物之一。
参考文献
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[5]张秀华. 龙葵提取物澳洲茄边碱对人胆管癌细胞生长及转移的影响[D].南京中医药大学,2018.