背景[1-3]
人胚肺细胞是1966年9月，J.P.Jacobs从一个14周大的男性胎儿的正常肺组织中获得了MRC-5细胞系。该细胞老化前能传代42到46次群体倍增。它是正常二倍体细胞系，46，XY核型。模式染色体数为46，概率为70%。
人胚肺细胞
细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
应用[4][5]
人胚肺细胞可以用于低剂量有机紫外防晒剂和全氟化合物对人胚肺细胞的毒性效应和机制研究
以包括二苯酮-3(BP-3),二苯酮-4(BP-4),奥里克林(OC),对甲氧基肉桂酸异辛酯(EHMC),丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷(BM-DBM)在内的五种防晒剂和包括全氟辛基磺酸(PFOS),全氟辛酸(PFOA),全氟壬酸(PFNA),全氟酸(PFHpA),全氟磺酸(PFHxS)在内的五种全氟化合物作为主要研究目标物,利用人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts,MRC-5)研究其低剂量暴露的细胞毒性效应和机制,为认识和评估这些新兴污染物的健康风险提供依据。
研究方法如下:(1)细胞培养及毒性试验用MTT法考察各浓度组MRC-5细胞存活率,以得出UV filters和PFCs急性暴露对于细胞生长和活力的影响。
(2)UV filters和PFCs对抗氧化防御系统的影响抗氧化防御系统是一项检验环境污染胁迫的重要指标。检验了几个抗氧化防御系统的重要指标,考察了超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性、还原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量、脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,从而确定UV filters和PFCs对MRC-5细胞抗氧化防御系统的影响。
(3) UV filters和PFCs对P-糖蛋白功能的影响考察UV filters和PFCs对罗丹明123外排的影响,从而确定UV filters和PFCs对细胞multixenobiotic resistance(MXR)机制的影响。
研究结果如下:(1)急性暴露24 h后各UV filters和PFCs均对人胚肺成纤维细胞的活力产生了显著影响。BP-3与各PFCs在环境相关水平显著刺激细胞生长,并显示出毒物兴奋效应;而除OC外,高剂量的UV filters和PFCs均显著抑制细胞活性。但整体上,经急性暴露后UV filters和PFCs对细胞活力的变化并无明显剂量-效应变化规律。
(2) 有机紫外防晒剂对人胚肺成纤维细胞抗氧化系统产生了影响,BP-3、EHMC、OC暴露组中SOD活性显著上升,所有暴露组中的CAT活性却都受到了抑制。EHMC和OC可显著影响MRC-5细胞抗氧化防御系统,尤其是在环境相关水平下时这种变化最为显著,高浓度的BP-3也显著影响了MRC-5细胞抗氧化防御系统。这五种紫外防晒剂均能导致细胞ROS升高(P<0.05)、GSH含量减少,脂质过氧化产物MDA含量变化无明显规律;全氟化合物也对MRC-5抗氧化防御系统产生了影响。PFOA暴露组中SOD活性显著增加,其余各组在低浓度水平时均明显抑制SOD活性,各组CAT活性受到了不同程度的影响。环境相关浓度的PFOS、PFNA和PFHxS以及高浓度(100μmol/L)的PFOA暴露对抗氧化防御系统产生了显著影响。各全氟化合物均导致细胞ROS增加(P<0.05),GSH含量和MDA含量则无太大变化。
(3)将细胞暴露于1μmol·L-1、10μmol·L-1和100μmol·L-1的UV filters和PFCs中24h后,发现各UV filters和PFCs都在一定程度上影响了人胚肺成纤维细胞的MXR机制,但其中的具体作用机制仍需进一步探究。
参考文献
[1]Contamination risk of raw drinking water caused by PFOA sources along a river reach in south-western Finland[J].Maiju Happonen;;Harri Koivusalo;;Olli Malve;;Noora Perkola;;Janne Juntunen;;Timo Huttula.Science of the Total Environment,2016
[2]Distribution and seasonal occurrence of UV filters in rivers and wastewater treatment plants in Korea[J].Kalu Ibe Ekpeghere;;Un-Jung Kim;;Sung-Hee O;;Hee-Young Kim;;Jeong-Eun Oh.Science of the Total Environment,2016
[3]Ultrasound-assisted emulsification microextraction followed by gas chromatography–mass spectrometry and gas chromatography–tandem mass spectrometry for the analysis of UV filters in water[J].Marlene Vila;;J.Pablo Lamas;;Carmen Garcia-Jares;;Thierry Dagnac;;Maria Llompart.Microchemical Journal,2016
[4]Perfluorinated compounds(PFCs)in the atmosphere of Shenzhen,China:Spatial distribution,sources and health risk assessment[J].Baolin Liu;;Hong Zhang;;Dan Yao;;Juying Li;;Liuwei Xie;;Xinxuan Wang;;Yanping Wang;;Guoqing Liu;;Bo Yang.Chemosphere,2015
[5]孙玲.低剂量有机紫外防晒剂和全氟化合物对人胚肺细胞的毒性效应和机制研究[D].上海交通大学,2016.